商品介紹:
本試劑盒是采用分光光度法檢測(cè)細(xì)胞或組織裂解液中caspase 1酶活性或純化的caspase 1酶活性的試劑盒,。本試劑盒用酶標(biāo)儀檢測(cè)或容量不超過(guò)100μl的分光光度檢測(cè)杯檢測(cè)時(shí),,除標(biāo)準(zhǔn)曲線外可以檢測(cè)20個(gè)樣品,。 |
試劑盒組分:
裂解液——————8ml
檢測(cè)緩沖液——————8ml
Ac-YVAD-pNA(2mM)———200μl
pNA(10mM)——————200μl
Caspase是一個(gè)在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起重要作用的蛋白酶家族,。Caspase 1也稱interkeukin 1b conberting enzyme(ICE),,有時(shí)被寫(xiě)作caspase-1或caspase 1,是caspase家族中可以剪切IL-1b前體蛋白或IL-18前體產(chǎn)生相應(yīng)成熟的細(xì)胞因子的caspase,。Caspase 11可以剪切45kD的caspase 1前體蛋白,,產(chǎn)生20kD和10kD的片段,這兩個(gè)片段可以形成異源二聚體(heterodimer),,并進(jìn)一步由兩個(gè)異源二聚體形成四聚體。Caspase 1可以通過(guò)剪切其凋亡Bcl-XL來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡,,并通過(guò)其對(duì)一些細(xì)胞因子前體的剪切來(lái)調(diào)控相關(guān)免疫反應(yīng),。
本caspase 1活性檢測(cè)試劑盒是基于caspase 1可以催化底物Ac-YVAD-pNA(acetyl-Tyr-Val-Ala-Asp p-nitroanilide)產(chǎn)生黃色的pNA(p-nitroaniline),從而可以通過(guò)測(cè)定吸光度來(lái)檢測(cè)caspase 1的活性,。pNA在405nm附近有強(qiáng)吸收,。
試劑盒中提供了caspase 1催化產(chǎn)生的黃色產(chǎn)物pNA,可以作為定量caspase 1酶活性的標(biāo)準(zhǔn)品,。
儲(chǔ)存條件:-20℃,。
產(chǎn)品屬于:
培養(yǎng)操作步驟:
1.用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出,用無(wú)菌絲綢布擦拭干凈,,不要用紗布,;
2.將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板(每孔一片)或培養(yǎng)皿中(每個(gè)平皿可放置2-3片);
3.在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時(shí),;
4.將經(jīng)過(guò)計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸浮液移入培養(yǎng)板中,,使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中;
5.將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天,,當(dāng)貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時(shí),,將培養(yǎng)板取出,用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片,,用蒸餾水漂洗后即可進(jìn)行快速固定以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè),。
實(shí)驗(yàn)報(bào)告:
一、分離與培養(yǎng):
1,、無(wú)菌條件下,,取出1-3d 齡SD大鼠心房組織,然后用PBS將此組織塊清洗2次,,最后將1mm3左右大?。?/span>
2、往組織塊中加入4 mL酶消化液(0.1% 胰酶和0.1% I型膠原酶),,混懸10s,,置37℃條件下消化10min,之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液,,自然沉淀并收集上清,,用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置;
3,、剩下的組織再加入3~4mL酶消化液,,混懸10s,置37℃消化10 min后,,按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置,,重復(fù)此步驟2-3次,直至組織*被消化,;
4,、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞消化液,1200r/min 離心10min,,棄去上清,,沉淀細(xì)胞用含有10% FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸,接種于25cm2培養(yǎng)瓶,,放置于37℃ ,,5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng);
5,、差速貼壁1h后,,吸出培養(yǎng)基,按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng),;
二,、免疫熒光鑒定:
1、待心房肌細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí),,棄去培養(yǎng)基,,用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次,每次10min,,然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min,;
2、PBS沖洗細(xì)胞2次,,每次10min,,然后在4℃條件下,用0.1%Triton X-100透膜15min,;
3,、PBS沖洗細(xì)胞2次,,每次10min,然后在室溫條件下,,用4% BSA封閉細(xì)胞30min,;
4、按1: 100的比例稀釋?duì)?actin一抗,,然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過(guò)夜,;
5、PBS沖洗細(xì)胞3次,,每次10min,,按1:150的比例稀釋抗α-actin的二抗, 37℃條件下放置1h,;
6,、用PBS沖洗3次,每次10min,,最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照,。
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Caspase 1 活性檢測(cè)試劑盒中性蛋白酶
其他分散酶
英文名稱:Neutral protease
其他英文名稱:Dispase
產(chǎn)品規(guī)格:BR,,50u/mg
包裝:250克
CAS號(hào):9068-59-1
級(jí)別:BR
活力:≥50units/mg
活力定義:1g固體酶粉,,在30 oC,PH7.5條件下,,1分鐘水解酪素產(chǎn)生1ug酪氨酸為1個(gè)酶活力單位,,以u(píng)/g表示
穩(wěn)定pH:5.5~8.5
適PH:6.8~7.0
適溫度:45~50℃
用途:生化研究。裂開(kāi)蛋白質(zhì)的肽鍵,,有的蛋白水解作用,,能水解纖維蛋白、黏蛋白,。
保存:-20℃