PCR實驗方法步驟:
方法
1:在冰浴中,,按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer
5 μl dNTP mix (2mM)
4 μl 引物1(10pM)
2 μl 引物2(10pM)
2 μl Taq酶 (2U/μl)
1 μl DNA模板(50ng-1μg/μl)
1 μl 加ddH2O至 50 μl
產(chǎn)品屬性:
產(chǎn)品名稱:肉毒桿菌F型(CB-F)核酸檢測試劑盒
規(guī)格:50T
分類:PCR檢測試劑盒
儲存條件:-20℃避光保存,,避免反復(fù)凍融,。
運輸:低溫、避光,,快遞免費送貨上門,。
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實驗過程:
一、試劑準(zhǔn)備 | 二,、操作步驟 |
1. DNA模板 2.對應(yīng)目的基因的特異引物(在PCR反應(yīng)中,,新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制,而不能從無到有,,憑空合成,。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物??梢允?span>DNA也可以是RNA,,一般20多bp,需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計,。因此,,擴增不同的基因需要設(shè)計不同的引物) 3.10×PCR Buffer 4.2mM dNTPmix:含dATP、dCTP,、dGTP,、dTTP各2mM 5.Taq酶 | 1.在冰浴中,按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中,。 10×PCR buffer 5μl dNTP mixl 4μl 引物1(10pM) 2μl 引物2(10PM) 2μl Taq酶(2U/μl) 1μl DNA模板(50ng-1μg/μl)???1 μl 加ddH2O至 50 μl 視PCR儀有無熱蓋,,不加或添加石蠟油。 |
2.調(diào)整好反應(yīng)程序,。將上述混合液稍加離心,立即置PCR儀上,,執(zhí)行擴增,。一般:在93℃預(yù)變性3-5min,,進(jìn)入循環(huán)擴增階段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循環(huán)30-35次,,zui后在72℃ 保溫7min,。
3.結(jié)束反應(yīng),PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃保存,。
4.PCR的電泳檢測:如在反應(yīng)管中加有石蠟油,,需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液,以除去石蠟油,;否則,,直接取5-10μl電泳檢測。
注意事項:
①加入試劑的順序應(yīng)一致,,以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時間一樣,。
②使用干凈的塑料容器配置洗滌液。
③按照雞血紅蛋白(HB)ELISA檢測試劑盒說明書中標(biāo)明的時間,、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作,。
④底物A應(yīng)揮發(fā),避免長時間打開蓋子,。底物B對光敏感,,避免長時間暴露于光下。避免用手接觸,,有毒,。實驗完成后應(yīng)立即讀取OD值。
⑤洗滌酶標(biāo)板時應(yīng)充分拍干,,不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水,。
⑥使用一次性的吸頭以免交叉污染,吸取終止液和底物A,、B液時,,避免使用帶金屬部分的加樣器 。
⑦實驗中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中,,密封保存,,以免變質(zhì)。
⑧試劑應(yīng)按標(biāo)簽說明書儲存,,使用前恢復(fù)到室溫,。稀稀過后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄,不可保存,。
⑨不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好,。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。
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儲存條件:
僅用于科研14℃或-20℃樣品收集,、處理及保存方法
1. 血清:使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,操作過程中避免任何細(xì)胞刺激,,收集血液后,,3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
2. 血漿:EDTA,、檸檬酸鹽或肝素抗凝,。3000 轉(zhuǎn)離心30 分鐘取上清。
3. 細(xì)胞上清液:3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘去除顆粒和聚合物,。
4. 組織勻漿:將組織加入適量生理鹽水搗碎,。3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘取上清。
5. 保存:如果樣本收集后不及時檢測,,請按一次用量分裝,,凍存于-20℃,避免反復(fù)凍融,,在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍