藻膽蛋白是源自微藻和藍細菌的光合作用光捕獲蛋白家族,。這些蛋白質(zhì)具有共價連接的線性四吡咯基團,，稱為藻膽素，其在捕獲光能中起關鍵作用,。在微藻和藍細菌中,，由這些藻膽素吸收的能量通過熒光共振能量轉移（FRET）有效地轉移到葉綠素色素用于光合作用反應,。

與化學合成熒光染料相比,，藻膽蛋白由于其相對高的熒光量子產(chǎn)率和消光系數(shù)而發(fā)出強烈的熒光信號。因為它們的熒光不被生物分子猝滅，所以藻膽蛋白可以在許多應用中用作有價值的熒光標簽。與生物分子（例如免疫球蛋白，蛋白A或鏈霉抗生物素蛋白）綴合的藻膽蛋白已經(jīng)在流式細胞術,，熒光激活細胞分選（FACS），組織化學，成像和有限程度的活性氧物種檢測中取得了巨大成功,。目前市面上主要兩種類型的藻膽蛋白是的藻紅蛋白（PE）和別藻藍蛋白（APC）,。

藻紅蛋白（PE）

PE（AAT-2558）顯示出非常明亮的黃橙色熒光,，消光系數(shù)（ε）為1,960,000cm -1 M -1  ,，量子產(chǎn)率（Φ）為0.84,。相比于Cy3® （141） 的消光系數(shù)是150000 M -1 cm -1  和量子產(chǎn)率（Φ）為0.24的,，PE熒光強度明顯強很多。

藻紅蛋白有兩種形式，從紅藻（RhodophytaI）中分離的R-藻紅蛋白（R-PE）和從紅毛菜目（Bangiales）中分離的B-藻紅蛋白（B-PE）,。B-PE和R-PE均由三種類型的亞基組成：α（~20 kDa）,，β（~20 kDa）和γ（~30 kDa）,。雖然它們具有相似的亞基結構，但由于它們的亞基的發(fā)色團含量不同導致其吸收峰的相對強度產(chǎn)生差異,。

R-PE和B-PE的吸光度和發(fā)射光譜的比較

別藻藍蛋白（APC）

APC（AAT-2554）呈現(xiàn)明亮的紅色熒光,，消光系數(shù)為700,000 M -1 cm -1  ，量子產(chǎn)率（Φ）為0.68,，相比于Cy5® （151）（消光系數(shù)ε=250000 M -1 cm -1,，量子產(chǎn)率（Φ= 0.20），APC熒光亮度明顯強很多,。 

APC的激發(fā)和發(fā)射光譜

與化學合成熒光染料相比，藻膽蛋白由于其相對高的熒光量子產(chǎn)率和消光系數(shù)而發(fā)出強烈的熒光信號,。因為它們的熒光不會被生物分子猝滅,，所以藻膽蛋白可以在許多應用發(fā)揮很大的作用。藻膽蛋白與生物分子（例如免疫球蛋白,，蛋白A或鏈霉抗生物素蛋白）綴合,，已經(jīng)在流式細胞術，熒光激活細胞分選（FACS）,，免疫熒光成像和有限程度的活性氧物種檢測中取得了巨大成功,，目前市面上主要的兩種的藻膽蛋白是的藻紅蛋白（PE）和別藻藍蛋白（APC）。

ReadiUse PE和APC

使用PE或APC進行流式細胞時,，首先必須將熒光蛋白與抗體綴合,。然而,，市售的藻膽蛋白濃縮在硫酸銨懸浮液中,，雖然兩者都表現(xiàn)出良好的長期穩(wěn)定性,，但在綴和前需要繁瑣的純化過程，例如透析,，硫酸鹽沉淀或凝膠過濾色譜,，一旦純化,，PE和APC必須冷藏,，不冷凍,，并在一個月內(nèi)使用,，以獲得超好的效果,。

AAT Bioquest開發(fā)了一種凍干純化藻膽蛋白的創(chuàng)新技術,，我們的ReadiUse 藻膽蛋白系列是不含硫酸銨的凍干粉末，去除這種強沉淀劑消除了純化過程,，并促進PE或APC與抗體和其他蛋白質(zhì)的快速綴合。以下是使用Buccutite 快速蛋白質(zhì)標記試劑盒（1315）的ReadiUse PE（2500）的簡要操作流程：

• 在H2O中重構ReadiUse PE
• 用Buccutite綴合激活PE和抗體
• 混合活化的PE和活化的抗體
• 使用脫鹽柱純化共軛物

比較不同儲存溫度對ReadiUse PE與ReadiUse APC的影響

在本研究中,，將分別在各種不同條件下儲存，隨后,，測試各種不同儲存條件對凍干的ReadiUse PE（2500）和ReadiUse APC（2503）藻膽蛋白的性能的影響及與新鮮的市售的含有硫酸銨藻膽蛋白作比較,。測試性能包括（對光譜特性,，熒光量子產(chǎn)率和標記效率的比較），在測試之前,，對市售的藻膽蛋白進行純化以除去硫酸銨,。

存儲條件

將ReadiUse PE和ReadiUse APC等分到1mg小瓶中,，并在四個不同溫度下儲存兩個月。溫度包括： 

• 市售液體（Fresh）- 懸浮在硫酸銨中的新鮮純化的藻膽蛋白（在當天制備）
• L - 4 oC - 凍干粉末,，ReadiUse PE和ReadiUse APC儲存于2-8 oC
• L - RT- 凍干粉末,，ReadiUsePE和ReadiUse APC在室溫下儲存
• L - （- 20 oC） - 凍干粉末，ReadiUse PE和ReadiUse APC儲存在< - 15 oC
• L -（- 65 oC）- 凍干粉末,，ReadiUse PE和ReadiUse APC儲存<-65 oC

不同儲存溫度對ReadiUse PE光譜特性的影響

我們在相同的條件和濃度下測量ReadiUse PE和市售新鮮純化的PE的吸光度和發(fā)射光譜,。下表數(shù)據(jù)表明，不同儲存條件下ReadiUse PE光學特性非常穩(wěn)定,，在常溫至-65o C下條件下保存約2個月,，在激發(fā)波長，發(fā)射波長和量子產(chǎn)率方面變化很小,。

不同儲存溫度對ReadiUse APC光譜特性的影響

在相同的條件和濃度下測量ReadiUse APC和新鮮純化的APC的吸光度和發(fā)射光譜,，下表數(shù)據(jù)表明,，ReadiUse APC光學特性非常穩(wěn)定，可在室溫至-65 o C下保存約2個月,，在激發(fā),，發(fā)射和量子產(chǎn)率方面變化很小。 

凍干ReadiUse PE和液體形式PE的標記效率

ReadiUse PE的標記效率是另一個需要檢查的重要因素,，因為它直接影響結合物的熒光產(chǎn)量,。標記效率可以通過計算標記程度來確定，標記程度是綴合后染料與蛋白質(zhì)（PE）的摩爾比,，使用Cy5綴合反應檢測ReadiUse PE 存儲在不同的溫度（4℃,，RT，-20℃和-65℃,，2個月）的反應性,。市售新鮮制備的PE以相同方式與Cy5綴合，并用作陽性對照,。

凍干的ReadiUse PE和新鮮PE標記效率的比較

凍干ReadiUse APC和液體形式APC的標記效率

使用Cy7綴合反應檢測ReadiUse APC的標記效率,。ReadiUse APC，存儲在不同的溫度（4℃,，RT,，-20℃和-65℃，2個月）,，新鮮制備的APC以相同方式與Cy7綴合,，并用作陽性對照,。

 凍干的ReadiUse APC和新鮮APC標記效率的比較

在HL-60細胞中檢測了ReadiUse PE-Cy5串聯(lián)和ReadiUse APC-Cy7串聯(lián)的性能,。使用Buccutite 快速蛋白質(zhì)綴合試劑盒（1315）將ReadiUse PE-Cy5串聯(lián)和ReadiUse APC-Cy7串聯(lián)綴合至GXM IgG。隨之使用Buccutite 綴合試劑盒用新鮮純化的PE-Cy5和PE-Cy7串聯(lián)制備綴合物,，并用作陽性對照,。結果表明，ReadiUse PE-Cy5和ReadiUse APC-Cy7綴合物在性能上與市售新鮮純化的PE-Cy5和APC-Cy7綴合物相當,。

結論：

AAT的ReadiUse PE和ReadiUse APC各方面性能與市售液體藻膽蛋白相當,，我們的凍干藻膽蛋白在不同儲存溫度下均非常穩(wěn)定（如RT，4℃和-20℃和-65℃）,，不會改變光譜特性,，標記效率和性能。此外,，ReadiUse PE和ReadiUse APC不含硫酸銨的粉末,，不需要任何純化（例如透析或脫鹽），顯著縮短了檢測時間,，提高了質(zhì)量的一致性和重組濃度的靈活性,，并且還減少了運輸成本,。

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