小G蛋白：超好的活化檢測試劑盒！

時間：2019/2/20閱讀：482

小G蛋白的共同特點是,，當結合了GTP時即成為活化形式，這時可作用于下游分子使之活化,，而當GTP水解成為GDP時(自身為GTP酶)則回復到非活化狀態(tài)。這一點與Gα類似,，但是小G蛋白的分子量明顯低于Gα,。

在細胞中存在著一些專門控制小G蛋白活性的小G蛋白調節(jié)因子，有的可以增強小G蛋白的活性,，如鳥苷酸交換因子（guanine nucleotide exchange factor, GEF）和鳥苷酸解離抑制因子（Guanine nucleotide dissociation Inhibitor, GDI）,，有的可以降低小G蛋白活性，如GTP酶活化蛋白（GTPase activating protein, GAP）,。

個被發(fā)現(xiàn)的小G蛋白是Ras,，它是Ras基因的產物。小G蛋白的Ras超家族由超過150個成員組成,，基于它們的序列同源性,，被分成若干亞家族，例如Rho,，Ras,，Ran，Rab,，Arf和Rad / Rem / Gem / Kir,。

小G蛋白超家族成員及其相關功能：

Ras	細胞增殖	DIRAS1; DIRAS2; DIRAS3; ERAS; GEM; HRAS; KRAS; MRAS; NKIRAS1; NKIRAS2; NRAS; RALA; RALB; RAP1A; RAP1B; RAP2A; RAP2B; RAP2C; RASD1; RASD2; RASL10A; RASL10B; RASL11A; RASL11B; RASL12; REM1; REM2; RERG; RERGL; RRAD; RRAS; RRAS2
Rho	細胞骨架的動力與形態(tài)	RHOA; RHOB; RHOBTB1; RHOBTB2; RHOBTB3; RHOC; RHOD; RHOF; RHOG; RHOH; RHOJ; RHOQ; RHOU; RHOV; RND1; RND2; RND3; RAC1; RAC2; RAC3; CDC42
Rab	膜轉運	RAB1A; RAB1B; RAB2; RAB3A; RAB3B; RAB3C; RAB3D; RAB4A; RAB4B; RAB; RAB5B; RAB5C; RAB6A; RAB6B; RAB6C; RAB7A; RAB7B; RAB7L1; RAB8A; RAB8B; RAB9; RAB9B; RABL2A; RABL2B; RABL4; RAB10; RAB11A; RAB11B; RAB12; RAB13; RAB14; RAB15;RAB17; RAB18; RAB19; RAB20; RAB21; RAB22A; RAB23; RAB24; RAB25; RAB26; RAB27A; RAB27B; RAB28; RAB2B; RAB30; RAB31; RAB32; RAB33A; RAB33B; RAB34; RAB35; RAB36; RAB37; RAB38; RAB39; RAB39B; RAB40A; RAB40AL;RAB40B; RAB40C; RAB41;RAB42; RAB43
Rap	細胞粘附	RAP1A; RAP1B; RAP2A; RAP2B; RAP2C
Arf	囊泡轉運	ARF1; ARF3; ARF4; ARF5; ARF6; ARL1; ARL2; ARL3; ARL4; ARL5; ARL5C; ARL6; ARL7; ARL8; ARL9; ARL10A; ARL10B; ARL10C; ARL11; ARL13A; ARL13B; ARL14; ARL15; ARL16; ARL17; TRIM23, ARL4D; ARFRP1; ARL13B
Ran	核運輸	RAN
Rheb	mTOR途徑	RHEB; RHEBL1
RGK		RRAD; GEM; REM; REM2
Rit		RIT1; RIT2
Miro	線粒體轉運	RHOT1; RHOT2

Ras蛋白主要參與細胞增殖和信號轉導；Rho蛋白對細胞骨架網(wǎng)絡的構成發(fā)揮調節(jié)作用,；Rab蛋白則參與調控細胞內膜交通（membrane traffic）,，其他家族成員也在細胞信號通路中發(fā)揮著非常重要的作用。

因此，研究GTP酶（GTPase）的活化調控機制具有廣泛而深遠的生物學意義,。

傳統(tǒng)檢測Rho 蛋白活化水平的方法主要為pull-down檢測,。pull-down法往往存在耗時長、需要樣本量大,、不太適合高通量檢測等缺點,。為克服傳統(tǒng)方法這些方面的缺點，Cytoskeleton公司開發(fā)了新一代的G-LISA™檢測方法,，用于快速簡便地檢測GTP酶活化水平,。

G-LISA實驗原理及操作步驟

1.首先將效應蛋白的受體結合域（RBD）包被96孔板；

2.樣本中GTP(活化狀態(tài))結合形式的蛋白分子則可結合到板上,，而GDP(無活性狀態(tài))結合形式蛋白則不結合,；

3.洗去未結合的蛋白；

4.然后依次加入特異性的一抗和HRP-二抗進行孵育結合,；

5.后利用合適的酶底物OPD或化學發(fā)光試劑顯色,。

Swiss 3T3 細胞中，Activators活化的Rho蛋白（左）和Rac蛋白（右）

傳統(tǒng)Pull down法和G-LISA法的比較

原理	用包被效應蛋白的親和磁珠選擇性的結合有活性的GTPase,，用western blot檢測信號	用包被效應蛋白的96孔板選擇性的結合有活性的GTPase 用ELISA檢測信號
實驗設備	SDS-PAGE,、Western blot相關儀器	ELISA相關儀器
上樣量	300 - 2000 µg per assay	5 - 50 µg per assay
樣品數(shù)量	Up to 10 samples	Up to 96 samples (or more)
結果定量	WB具有很窄的線性范圍。此外,，樣品的多次操作也會導致某種程度上的變異分析,。	提供定量的數(shù)字讀數(shù)
反應時間	10-12h	＜3h