KP-3導(dǎo)管癌細(xì)胞

注意事項(xiàng)如下:

1 收到細(xì)胞后首先觀察T-25瓶是否有損壞,、漏液,、渾濁等現(xiàn)象，若有上述現(xiàn)象發(fā)生請(qǐng)及時(shí)和我們聯(lián)系,。

2 對(duì)于貼壁細(xì)胞,，若細(xì)胞漂浮:培養(yǎng)瓶不開封,，用75%酒精擦拭后平躺置于培養(yǎng)箱內(nèi),。次日觀察，如細(xì)胞大部分又貼回瓶底,，表明細(xì)胞活力正常,，剩余漂浮的細(xì)胞可以去掉;如細(xì)胞還不貼壁，將細(xì)胞離心收集移到新的培養(yǎng)瓶中,，原培養(yǎng)瓶加部分培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),，中間注意觀察，我們的技術(shù)人員會(huì)一直跟蹤指導(dǎo),，直到問題解決,。

3 建議客戶收到細(xì)胞后前3天各拍幾張細(xì)胞照片,，記錄細(xì)胞狀態(tài)，便于和本公司技術(shù)部溝通交流,。

素爾細(xì)胞庫提供遺傳變異細(xì)胞系,、正常組織來源細(xì)胞系、腫瘤細(xì)胞系,、工程細(xì)胞系,、干細(xì)胞系，涉及人類,，大鼠,、小鼠、鳥類,、倉鼠,、魚類、貓類,、狗,、牛、貂,、豬,、恒河猴、長鼻袋鼠等,。

第三節(jié) 天然細(xì)胞培養(yǎng)基

天然培養(yǎng)基是指來自動(dòng)物體液或利用組織分離提取的一類培養(yǎng)基,，如血漿、血清,、淋巴液,、雞胚浸出液等。組織培養(yǎng)技術(shù)建立早期,，體外培養(yǎng)細(xì)胞都是利用天然培養(yǎng)基,。但是由于天然培養(yǎng)基制作過程復(fù)雜、批間差異大,，因此逐漸為合成培養(yǎng)基所替代,。目前廣泛使用的天然培養(yǎng)基是血清，另外各種組織提取液,、促進(jìn)細(xì)胞貼壁的膠原類物質(zhì)在培養(yǎng)某些特殊細(xì)胞也是必不可少,。

一、血清(serum)細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展,，培養(yǎng)基的質(zhì)量又是關(guān)鍵,，而培養(yǎng)基的主要成份中動(dòng)物血清對(duì)細(xì)胞的生長繁殖發(fā)揮著重要甚至是難以替代的作用。在動(dòng)物血清的應(yīng)用中牛血清又是較為廣泛的，所以血清是醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)品中重要的原材料之一,。保證血清質(zhì)量也是促進(jìn)生物制品質(zhì)量提高的重要環(huán)節(jié),。

1、血清種類:目前用于組織培養(yǎng)的血清主要是牛血清,，培養(yǎng)某些特殊細(xì)胞也用人血清,、馬血清等。選擇用牛血清培養(yǎng)細(xì)胞的原因:來源充足,、制備技術(shù)成熟,、經(jīng)過長時(shí)間的應(yīng)用考驗(yàn)人們對(duì)其有比較深入的理解。牛血清對(duì)絕大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞都是適合的,，但并不排除在培養(yǎng)某種細(xì)胞時(shí)使用其他動(dòng)物血清更合適,。

牛血清是細(xì)胞培養(yǎng)中用量最大的天然培養(yǎng)基，含有豐富的細(xì)胞生長必須的營養(yǎng)成份,，具有極為重要的功能,。牛血清分為小牛血清、新牛血清,、胎牛血清,。胎牛血清應(yīng)取自剖腹產(chǎn)的胎牛;新牛血清取自出生24小時(shí)之內(nèi)的新生牛;小牛血清取自出生10-30天的小牛。顯然,，胎牛血清是品質(zhì)最高的,，因?yàn)樘ヅ＿€未接觸外界，血清中所含的抗體,、補(bǔ)體等對(duì)細(xì)胞有害的成分最少,。

2、血清的主要成分:血清是由血漿去除纖維蛋白而形成的一種很復(fù)雜的混合物,，其組成成份雖大部分已知,，但還有一部分尚不清楚，且血清組成及含量常隨供血?jiǎng)游锏男詣e,、年齡,、生理?xiàng)l件和營養(yǎng)條件不同而異。血清中含有各種血漿蛋白,、多肽,、脂肪、碳水化合物,、生長因子,、激素、無機(jī)物等,，這些物質(zhì)對(duì)促進(jìn)細(xì)胞生長或抑制生長活性是達(dá)到生理平衡的。對(duì)血清的成分和作用的研究雖有很大進(jìn)展,，但仍存在一些問題,。主要是:

*:血清的成份可能有幾百種之多,，目前對(duì)其準(zhǔn)確的成份、含量及其作用機(jī)制仍不清楚,，尤其是對(duì)其中一些多肽類生長因子,、激素和脂類等尚未充分認(rèn)識(shí)，這給研究工作帶來許多困難;

第二:血清都是批量生產(chǎn),，各批量之間差異很大,，而且血清保存期至多一年，因此,，要保證每批血清的相似性極為困難,，從而使實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化和連續(xù)性受到限制;

第三:不能排除血清中含有易變物質(zhì)，這被認(rèn)為是“瓶中惡化”的原因之一,。

3,、血清主要作用:

提供基本營養(yǎng)物質(zhì):氨基酸、維生素,、無機(jī)物,、脂類物質(zhì)、核酸衍生物等,，是細(xì)胞生長必須的物質(zhì),。

提供激素和各種生長因子:胰島素、腎上腺皮質(zhì)激素,、類固醇激素(雌二醇,、睪酮、孕酮)等,。生長因子如成纖維細(xì)胞生長因子,、表皮生長因子、血小板生長因子等,。

提供結(jié)合蛋白:結(jié)合蛋白作用是攜帶重要地低分子量物質(zhì),，如白蛋白攜帶維生素、脂肪,、以及激素等,，轉(zhuǎn)鐵蛋白攜帶鐵。結(jié)合蛋白在細(xì)胞代謝過程中起重要作用,。

提供促接觸和伸展因子使細(xì)胞貼壁免受機(jī)械損傷,。

對(duì)培養(yǎng)中的細(xì)胞起到某些保護(hù)作用:有一些細(xì)胞，如內(nèi)皮細(xì)胞,、骨髓樣細(xì)胞可以釋放蛋白酶,，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。這種作用是偶然發(fā)現(xiàn)的,，現(xiàn)在則有目的的使用血清來終止胰蛋白酶的消化作用,。因?yàn)橐鹊鞍酌敢呀?jīng)被廣泛用于貼壁細(xì)胞的消化傳代。血清蛋白形成了血清的粘度,，可以保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械損傷,，特別是在懸浮培養(yǎng)攪拌時(shí)，粘度起到重要作用,。血清還含有一些微量元素和離子,，他們?cè)诖x解毒中起重要作用，如SeO₃,硒等,。

4,、細(xì)胞培養(yǎng)中使用血清的缺點(diǎn)

血清成分復(fù)雜，雖含許多對(duì)細(xì)胞有利成分,，也含有對(duì)細(xì)胞有害的成分,，使血清有幾個(gè)明顯的缺點(diǎn):

對(duì)大多數(shù)細(xì)胞，在體內(nèi)狀態(tài),，血清不是它們接觸的生理學(xué)液體,，只是在損傷愈合以及血液凝固過程中才接觸血清，因此使用血清有可能改變某種細(xì)胞在體內(nèi)的正常狀態(tài),，血清可能促進(jìn)某些細(xì)胞的生長(成纖維細(xì)胞)同時(shí)抑制另一類細(xì)胞生長(表皮細(xì)胞),。

血清含一些對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性的物質(zhì)，如多胺氧化酶,，能與來自高度繁殖細(xì)胞的多胺反應(yīng)(如精胺,、亞精胺)形成有細(xì)胞毒性作用的聚精胺。補(bǔ)體,、抗體,、細(xì)菌毒素等都會(huì)影響細(xì)胞生長，甚至造成細(xì)胞死亡,。

動(dòng)物個(gè)體不同,，血清產(chǎn)地、批號(hào)不同,，每批質(zhì)量差異甚大,，其成分不能保持*。

取材中可能帶入支原體,、病毒,，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生潛在影響，可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗或?qū)嶒?yàn)結(jié)果不可靠性,。

血清的使用使得實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化困難,，其中的蛋白質(zhì)使得某些轉(zhuǎn)基因蛋白生物藥品生產(chǎn)中分離純化工作很難完成,。

大規(guī)模生產(chǎn)中，血清來源越來越困難,，價(jià)格昂貴,，是構(gòu)成動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)生產(chǎn)成本的主要部分之一,。

5,、血清的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn):血清質(zhì)量高低取決于兩方面因素:一是取材對(duì)象，二是取材過程,。用于取材的動(dòng)物應(yīng)健康無病并且在的出生天數(shù)之內(nèi),，取材過程應(yīng)嚴(yán)格按照操作規(guī)程執(zhí)行，制備出的血清要經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量鑒定,。WHO公布的《用動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)生產(chǎn)生物制品規(guī)程》中的要求:

牛血清必須來自有文件證明無牛海綿狀腦病的牛群或國家,。并應(yīng)具備適當(dāng)?shù)谋O(jiān)測(cè)系統(tǒng)。

有些國家還要求牛血清來自未用過反芻動(dòng)物蛋白飼料的牛群,。

證明所用牛血清中不含對(duì)所生產(chǎn)疫苗病毒的抑制物,。

血清要通過濾膜過濾除菌，保證無菌,。

無細(xì)菌,、霉菌、支原體和病毒的污染,，有些國家要求無細(xì)菌噬菌體污染,。

對(duì)細(xì)胞有良好的支持繁殖作用。

我國在對(duì)牛血清的質(zhì)量2000年版《中國生物制品主要原輔料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)》中提出比較嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)要求,。包括蛋白質(zhì)含量,，細(xì)菌、真菌,、支原體,、牛病毒、大腸桿菌噬菌體,、細(xì)菌內(nèi)毒素,，支持細(xì)胞增殖檢查。

血清質(zhì)量的鑒定一般包括以下幾個(gè)方面:

理化性質(zhì):如滲透壓,、pH值,、蛋白電泳圖譜、蛋白含量,、激素水平,、內(nèi)毒素等。蛋白含量包括血清總蛋白含量(不低于35-45g/L),、球蛋白含量(應(yīng)小于20g/L),、血紅蛋白含量等,。其中球蛋白含量是一項(xiàng)非常重要的指標(biāo)，血清中球蛋白主要是抗體,，球蛋白含量越低血清質(zhì)量越高,。血紅蛋白也是越低越好。

微生物檢測(cè):包括細(xì)菌,、真菌,、支原體、病毒等,。特別是對(duì)支原體,、病毒的檢測(cè)，支原體是一種很小的微生物,，可通過孔徑22u的濾膜,。支原體、病毒污染在光學(xué)顯微鏡下難于察覺,，細(xì)胞也能生長繁殖,，但會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。檢測(cè)支原體的方法很多,，如培養(yǎng)法,、PCR法、熒光染色法,、電鏡觀察法等,。

KP-3導(dǎo)管癌細(xì)胞

促生長效果:這是血清重要的特性之一，應(yīng)當(dāng)以培養(yǎng)的細(xì)胞來檢測(cè),。有兩種方法:克隆形成率,、貼瓶率測(cè)定法和連續(xù)傳代培養(yǎng)法。

(1)克隆形成率測(cè)定:一般以懸浮生長的細(xì)胞為培養(yǎng)對(duì)象,，按有限稀釋法做克隆化培養(yǎng),，將不同批號(hào)的血清配制成不同濃度的培養(yǎng)基，細(xì)胞也稀釋成不同濃度,，接種到96孔板,，每孔200ul，培養(yǎng)一定時(shí)間,，統(tǒng)計(jì)有克隆生長的孔,，計(jì)算出百分比，再與對(duì)照的標(biāo)準(zhǔn)血清相比較,，就可看出不同批號(hào)血清間的區(qū)別,。比較低的濃度，更能觀察出血清質(zhì)量間的細(xì)微差別,。

(2)貼瓶率測(cè)定:是以貼壁細(xì)胞為培養(yǎng)對(duì)象,，將細(xì)胞稀釋至低密度,，接種至平皿，每皿200或100個(gè)細(xì)胞,，以不同濃度的血清培養(yǎng)基培養(yǎng),，培養(yǎng)一定時(shí)間后棄培養(yǎng)基，染色后統(tǒng)計(jì)集落數(shù),，計(jì)算出集落數(shù)占接種細(xì)胞數(shù)的百分比,，同樣再與標(biāo)準(zhǔn)血清比較，判斷血清質(zhì)量高低,。

(3)連續(xù)傳代培養(yǎng)法:是將細(xì)胞培養(yǎng)于3個(gè)一定體積的培養(yǎng)瓶中,，待測(cè)血清配制為5%濃度,，一般于第七天收集細(xì)胞,，計(jì)數(shù)，取平均值,，中間可以更換一次培養(yǎng)基,。連續(xù)測(cè)試三個(gè)周期以上，觀察細(xì)胞生長狀況,，并將每次的計(jì)數(shù)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)血清的測(cè)試結(jié)果比較,。

對(duì)于使用者，判斷血清質(zhì)量先從外觀入手,。好的血清應(yīng)該是透明清亮,，土黃色或棕黃色，無沉淀或極少沉淀,，比較粘稠,。如發(fā)現(xiàn)血清渾濁、不透明,、含許多沉淀物,，說明血清污染或血清中的蛋白質(zhì)變性;若血清呈棕紅色，說明血清中的血紅蛋白含量太高,，取材時(shí)有溶血現(xiàn)象;如果搖晃時(shí)感覺液體稀薄,，說明血清中摻入的生理鹽水太多。如果要進(jìn)一步了解血清的質(zhì)量,，則應(yīng)連續(xù)培養(yǎng)某些細(xì)胞,，觀察細(xì)胞生長狀況。

6,、血清的使用與儲(chǔ)存:正確的使用及保存血清,，才能使血清發(fā)揮應(yīng)有的作用。

使用前處理:大部分血清在使用前必須滅活處理,，即56℃30分鐘,。滅活的目的是去除血清中的補(bǔ)體成分,，避免補(bǔ)體對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。血清經(jīng)過滅活也會(huì)損失一些對(duì)細(xì)胞有利的成分,，如生長因子,，因此也有人提出血清不經(jīng)滅活直接用于培養(yǎng)，這樣做的前提是確認(rèn)血清中不含補(bǔ)體成分,。對(duì)于一些品質(zhì)高的胎牛血清和新牛血清可以考慮不經(jīng)滅活直接用于細(xì)胞培養(yǎng),。

儲(chǔ)存條件:血清一般儲(chǔ)存于-20℃，同時(shí)應(yīng)避免反復(fù)凍融,。購買大包裝的血清后,，首先要滅活處理，然后分裝成小包裝,，儲(chǔ)存于-20℃,，使用前融化。融化時(shí)現(xiàn)置于4℃,。融化后的血清在4℃不宜長時(shí)間存放,，應(yīng)盡快使用。

使用濃度:自從有了合成培養(yǎng)基,，血清就是作為一種添加成分與合成培養(yǎng)基混合使用,，使用濃度一般為5-20%，較常用是10%,。過多血清容易使培養(yǎng)中的細(xì)胞發(fā)生變化,，特別是一些二倍體的無限細(xì)胞系，迅速生長之后容易發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化,。 采購血清時(shí),先從供應(yīng)商處索取樣品進(jìn)行試驗(yàn),，選定一批后就要保留足夠使用6個(gè)月至1年的量，直至用另一批經(jīng)過預(yù)先試驗(yàn)的樣品代替,。

二,、胚胎浸出液

胚胎浸出液(embryonic extract)是早期動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)用的天然培養(yǎng)基，現(xiàn)已很少使用,。

三,、水解乳蛋白 水解乳蛋白(lactalbumin hydrolysate)為乳白蛋白經(jīng)蛋白酶和肽酶水解的產(chǎn)物，含有豐富的氨基酸,，是常用的天然培養(yǎng)基,，可用于許多細(xì)胞和原代細(xì)胞的培養(yǎng)。