HCT-8/VCR人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞長春新堿耐藥株

形態(tài)特性 上皮樣；多角形

生長特性 貼壁生長

特征特性 長春新堿耐藥,。

培養(yǎng)條件 RPMI 1640 (w/o Hepes) 10%FBS + 2000ng/ml長春新堿

傳代方法 1:4~1:8傳代,，2~3天換液1次。

傳代情況

凍存條件 基礎(chǔ)培養(yǎng)基+8%DMSO+38%FBS

運(yùn)輸和保存

1)1mL凍存細(xì)胞懸液裝于1.8ml的凍存管中,，置于裝滿干冰的泡沫保溫盒中進(jìn)行運(yùn)輸,；收到細(xì)胞后請盡快解凍復(fù)蘇細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，如無法立刻進(jìn)行復(fù)蘇操作,，凍存細(xì)胞可在-80℃的條件下保存1個月,。
2)T-25培養(yǎng)瓶充滿*培養(yǎng)基后進(jìn)行常溫運(yùn)輸；收到細(xì)胞后請鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài),，如鋪瓶率超過85%請立即進(jìn)行傳代操作,，如懸浮的細(xì)胞較多，請將培養(yǎng)瓶至于培養(yǎng)箱中靜置過夜以幫助未死亡的懸浮細(xì)胞能夠再次貼壁,。

HCT-8/VCR人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞長春新堿耐藥株

培養(yǎng)步驟

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1） 準(zhǔn)備基礎(chǔ)培養(yǎng)基( GIBCO,，，添加NaHCO3 1.5g/L，丙酮酸鈉 0.11g/L),；優(yōu)質(zhì)胎牛血清,，10%。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣,，95%,；二氧化碳，5%,。 溫度：37攝氏度,，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%*培養(yǎng)基,，10%DMSO,，現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲存,。

二． 細(xì)胞處理：

1） 復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍,，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘,，棄去上清液,，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中,，加入約8ml培養(yǎng)基,，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度,。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%,，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

對于貼壁細(xì)胞,，傳代可參考以下方法：

1. 棄去培養(yǎng)上清,，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次,。

2. 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中,，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況,，若細(xì)胞大部分變圓并脫落,，迅速拿回操作臺,，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化,。

3. 按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出,，在1000RPM條件下離心4分鐘,，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4. 將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中,。

3）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時,，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。貼壁細(xì)胞凍存時,，棄去培養(yǎng)基后加入少量胰酶,，細(xì)胞變圓脫落后，加入約1ml含血清的培養(yǎng)基后加入凍存管中,，再添加10%DMSO后進(jìn)行凍存,。

細(xì)胞注意事項(xiàng)：

1.收到細(xì)胞后首先觀察細(xì)胞瓶是否完好，培養(yǎng)液是否有漏液,、渾濁等現(xiàn)象,，若有上述現(xiàn)象發(fā)生請及時和我們聯(lián)系。

2.先不開瓶蓋,，瓶身擦拭酒精后放在培養(yǎng)箱靜置數(shù)小時（4h左右）,，穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)，切忌在溫箱內(nèi)靜置過夜,。

3.靜置后鏡檢,，拍照，記錄細(xì)胞狀態(tài),。建議傳代后也拍照記錄細(xì)胞生長情況,。

4.  懸浮細(xì)胞：將細(xì)胞瓶內(nèi)液體都轉(zhuǎn)移至無菌離心管內(nèi)，1000 轉(zhuǎn)/分鐘離心5min,，培養(yǎng)基上清可備用,，管底細(xì)胞沉淀用培養(yǎng)基重懸。鏡檢時若細(xì)胞密度超過80%,，可將細(xì)胞懸液分至2個細(xì)胞瓶內(nèi)培養(yǎng),；若密度未超過80%，細(xì)胞懸液移至原瓶繼續(xù)培養(yǎng),，待達(dá)到80%時再正常傳代,。備注：聚團(tuán)生長慢，有密度依賴,，必須使用T25培養(yǎng)瓶豎立培養(yǎng),，3天一次半量換液一次，1-2周傳代一次,。

貼壁細(xì)胞：若細(xì)胞密度超過80%,，可正常傳代；若未超過80%,，收集細(xì)胞瓶內(nèi)的培養(yǎng)基,，留8ml繼續(xù)培養(yǎng)至80%左右再傳代,，瓶蓋可稍微擰松。備注：細(xì)胞貼壁慢,，傳代后細(xì)胞放2天不動,。

5.細(xì)胞瓶內(nèi)的培養(yǎng)基含血清和雙抗，可收集后4℃保存?zhèn)溆?，可補(bǔ)加2%血清,。剛開始傳代時建議一半用細(xì)胞瓶內(nèi)的培養(yǎng)基，一半用客戶自備的培養(yǎng)基,，使細(xì)胞逐漸適應(yīng)培養(yǎng)條件,，以免因不適應(yīng)而造成生長狀態(tài)不佳。