H9C2大鼠心肌細(xì)胞

H9C2大鼠心肌細(xì)胞

 操作步驟：

1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有 1mL 細(xì)胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加 入 4mL 培養(yǎng)基混合均 勻,。在 1000RPM 條件下離心 4 分鐘,，棄去上清液，補(bǔ) 加 1-2mL 培養(yǎng)基后吹勻,。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培 養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)?細(xì)胞懸液加入 10cm 皿中,，加入約 8ml 培養(yǎng)基,，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并 檢查細(xì)胞密度,。

 2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá) 80%-90%,，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。      
     1. 棄去培養(yǎng)上清,，用不含鈣,、鎂離子的 PBS 潤(rùn)洗細(xì)胞 1-2 次。
     2. 加 1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中,，置于 37℃培 養(yǎng)箱中消化 1-2 分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況,，若細(xì)胞大部分 變圓并脫落,，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng) 瓶后加少量培養(yǎng)基終止消 化,。     
     3. 按 6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基,，輕輕打勻后吸出，在 1000RPM 條件下離心 4 分 鐘,，棄去上清液,，補(bǔ)加1-2mL 培養(yǎng)液后吹勻。
     4. 將細(xì)胞懸液按 1：2 比例分到新的含 8ml 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中,。
 3）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí),，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面 T25 瓶為類(lèi),；
    1. 細(xì)胞凍存時(shí),，棄去培養(yǎng)基后，PBS 清洗一遍后加入 1ml 胰酶,，細(xì)胞變圓 脫 落后,，加入 1ml 含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),。
    2. 4 min 1000rpm 離心去掉上清,。加 1ml 血清重懸細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加 入血 清和 DMSO,，輕輕混勻,，DMSO 終濃度為 10%，細(xì)胞密度不低于1x106/ml,，每支凍存管凍存 1ml 細(xì)胞懸液,，注意凍 存管做好標(biāo)識(shí)。
    3. 將凍存管置于程序降溫盒中,，放入-80 度冰箱,，2 個(gè)小時(shí)以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存,。記錄凍存管位置以便下次拿取。

 注意事項(xiàng)：

1.動(dòng)作要快,，胰酶消化,，換液什么，細(xì)胞暴露在空氣中的時(shí)間越少越好,。另外,，要掌握好胰酶消化時(shí)間，所謂的細(xì)胞狀態(tài)差,，很多時(shí)候是傳代的原因,。
3.有時(shí)間的話，需要細(xì)胞計(jì)數(shù),，傳相應(yīng)數(shù)目的細(xì)胞到培養(yǎng)皿中,，可以大致清楚細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，不會(huì)臨時(shí)要處理,，手足無(wú)措,。
3.要做什么心里要非常清楚，合理安排時(shí)間,，細(xì)胞房的實(shí)驗(yàn)穿插進(jìn)行,，可以節(jié)省很多時(shí)間，也不會(huì)耽誤別人的實(shí)驗(yàn),。
4.個(gè)人的實(shí)驗(yàn)器具自己收一套,，不要和別人混用，zui近換了什么新的東西稍微記一下,，試劑一旦懷疑污染,，馬上丟。
5.細(xì)胞房不能進(jìn)去太多人,，避免相互干擾,。