您好, 歡迎來到化工儀器網(wǎng)
8
蛋白酶k的使用方法及作用有哪些呢？
蛋白酶K,，是一種切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶,。它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵。此酶經(jīng)純化去除了RNA酶和DNA酶活性,。由于蛋白酶K在尿素和SDS中穩(wěn)定,，還具有降解天然蛋白質(zhì)的能力，因而它應(yīng)用很廣泛,，包括制備脈沖電泳的染色體 DNA,，蛋白質(zhì)印跡以及去除DNA和RNA制備中的核酸酶。蛋白酶K的一般工作濃度是50—100μg/ml。在較廣的pH范圍內(nèi)(pH 4-12.5)均有活性,。
推薦反應(yīng)緩沖液：50mM Tris-HCl (pH7.5),10mM CaCl2 ,。
蛋白酶K配制標(biāo)準(zhǔn)：20mg/ml蛋白酶K配制標(biāo)準(zhǔn)(proteinase K)：將200mg的蛋白酶K加入到9.5ml水中，輕輕搖動,，直至蛋白酶K*溶解,。不要渦旋混合。加水定容到10ml,，然后分裝成小份貯存于-20℃,。
蛋白酶K的保存：保存在-20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融,，有效保證12月,。
孵育溫度為55至65℃，理想孵育溫度為58℃,，孵育時間為15分鐘至48小時;理想孵育時間為2小時,。
作用：蛋白酶K在原位雜交技術(shù)中通常用于雜交前的處理，它具有消化包圍靶DNA蛋白質(zhì)的作用,，以增加探針與靶核酸結(jié)合的機會,，提高雜交信號.但蛋白酶K的濃度過高、消化時間過長或孵育溫度過高時,，都會對細(xì)胞的結(jié)構(gòu)有一定的破壞,，導(dǎo)致組織切片的脫落，細(xì)胞核 的消失,，從而影響雜交結(jié)果,。EDTA緩沖液可以替代蛋白酶K的作用，解決上述出現(xiàn)的問題,，并能達(dá)到理想的染色效果,。
蛋白酶K的應(yīng)用比較廣泛，它可以消化包圍靶DNA蛋白,，因此使用蛋白酶K能夠增加探針 與靶核酸結(jié)合的機會增強雜交信號,，但在使用蛋白酶K時要主要使用的濃度，過高或者過低都會破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu),、核消失等影響試驗結(jié)果,。