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接上期,，30年前的無血清培養(yǎng)基里都含啥
三,、無血清培養(yǎng)基
1979年神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)出現(xiàn)了一個(gè)重要進(jìn)展，用化學(xué)添加劑即可維持神經(jīng)細(xì)胞存活與生長而不需要在培養(yǎng)基中添加血清,。其工作基礎(chǔ)是用合適的激素,、營養(yǎng)物和促貼壁的物質(zhì)的組合置換培養(yǎng)基中的成分，后找到了適合大多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)的試劑配方,，該配方稱為N2,，專門用于神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)，早是用在B104大鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系的培養(yǎng),。它的基礎(chǔ)培養(yǎng)基是1：1的DMEM與H12的混合液,，添加了胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白,、腐胺和硒,。胰島素和胰島素樣生長因子對于大多數(shù)類型細(xì)胞的存活和生長有重要作用，硒是谷胱甘肽產(chǎn)生的合作因子,，可能有助于過氧化物和超氧化物的水解,，有報(bào)道說還能防止細(xì)胞的光照損傷。隨后的其他配方如N1N3則含有較低濃度的轉(zhuǎn)鐵蛋白,。
未料到的是上述配方構(gòu)成的培養(yǎng)基可以支持神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系快速增殖,，隨后又發(fā)展了能支持原代培養(yǎng)的各種神經(jīng)元生長的培養(yǎng)基，這種培養(yǎng)基在許多實(shí)驗(yàn)室里已取代了有血清培養(yǎng),。在某些培養(yǎng)方案中,，細(xì)胞直接進(jìn)入無血清培養(yǎng),，這樣的培養(yǎng)基可以消除來自血清的不均一性,。更為重要的是,，它們可用來檢測生長因子以及其他促進(jìn)神經(jīng)元存活或生長的因子，或者用來檢測那些可保護(hù)神經(jīng)元免遭環(huán)境毒物損傷的制劑,。于神經(jīng)元的培養(yǎng)基在某些培養(yǎng)環(huán)境中還可以減低非神經(jīng)元細(xì)胞的增殖,，故可使神經(jīng)元純化。
血清中含有的組分,，例如血清蛋白,，可作為代謝毒物清除劑使用并能聚集于培養(yǎng)基中。當(dāng)缺乏這些成分時(shí),，如神經(jīng)元在無血清培養(yǎng)基中生長時(shí),，特別容易為過氧化物及自由基傷害，這已被許多研究者注意到了,。過氧化物酶以及超氧化物歧化酶可阻止培養(yǎng)基中過氧化物和超氧化物的累積,，有報(bào)道講可以促進(jìn)低密度培養(yǎng)細(xì)胞的存活。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活可為氧分壓的下降而促進(jìn),。因而,，無血清培養(yǎng)基的配方常含有抗氧化劑的試劑。例如,，維生素E和丙酮酸,，可作為過氧化物清除劑使用。上述這些影響在高密度培養(yǎng)時(shí)變小,，特別是神經(jīng)元與膠質(zhì)共培養(yǎng)時(shí),，它們可以吸收和代謝神經(jīng)元毒性物質(zhì)如谷氨酸。
應(yīng)該注意,，盡管無血清培養(yǎng)基是有化學(xué)限定性的,，但在培養(yǎng)過程中它仍有變動(dòng)，培養(yǎng)起始時(shí)可能有些物質(zhì)缺乏,，而后細(xì)胞的產(chǎn)物可能積累,，從而使培養(yǎng)基的成分改變。這其實(shí)是有另一方面的好處,，即條件培養(yǎng)基（已培養(yǎng)過細(xì)胞的培養(yǎng)基）的形成,，條件培養(yǎng)基常常用來增加神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育。
生長因子絕大多數(shù)哺乳類胚胎神經(jīng)元有嚴(yán)格的營養(yǎng)要求,，若不能提供適宜的生長因子或合適的因子組分,，將會(huì)使絕大多數(shù)神經(jīng)元在體外培養(yǎng)的數(shù)天中死亡。解決這一問題有兩條思路,，一是讓培養(yǎng)細(xì)胞提供自己的營養(yǎng)因子,，二是在培養(yǎng)基中加入純的生長因子,。如果細(xì)胞混合物能在高密度時(shí)生長，所需的生長因子便會(huì)積累到可觀的數(shù)值,，尤其當(dāng)培養(yǎng)基很少變化時(shí),。若某種細(xì)胞混合物生長時(shí)有很少的營養(yǎng)需求，可保持培養(yǎng)基在一段時(shí)間里不作任何變動(dòng),，以使?fàn)I養(yǎng)（生長）因子積累,，而后促使所需要的細(xì)胞類型能夠生長。但是,，這種對營養(yǎng)（生長）因子自身倚賴性亦有弊端,，因?yàn)橥ǔＴ诨旌霞?xì)胞群體中細(xì)胞很難有同比例增殖，某些細(xì)胞會(huì)因生長條件的貧乏而受限制,。另外,，這種方法只能進(jìn)行相當(dāng)高密度的細(xì)胞培養(yǎng)。因?yàn)榕囵B(yǎng)基的條件在細(xì)胞的較低密度時(shí)變的不夠有效,。不過某些時(shí)候純化神經(jīng)元群體的低密度培養(yǎng)可用條件培養(yǎng)基（經(jīng)過了高密度培養(yǎng)）進(jìn)行,，或在膠質(zhì)上生長的神經(jīng)元所用過的培養(yǎng)基來支持。
滿足神經(jīng)元營養(yǎng)需求的第二條途徑是向培養(yǎng)基中加入生長因子,。通常用于組培的通用適宜因子是神經(jīng)生長因子NGF,。不過，只有少數(shù)對這種蛋白質(zhì)有反應(yīng)的細(xì)胞類型的細(xì)胞才能生長,。
許多PNS類型的神經(jīng)元在離體狀態(tài)時(shí)表現(xiàn)出簡單的營養(yǎng)需求,，只需提供單一的營養(yǎng)因子就足以使其在低密度時(shí)增殖。例如,，大鼠交感神經(jīng)元僅需NGF即能存活,，在其生存期間，這些神經(jīng)元可在嚴(yán)格局限條件下生長好幾個(gè)月（即在無血清培養(yǎng)基中,、或缺乏膠質(zhì)細(xì)胞,、或在化學(xué)限定基質(zhì)上）。有證據(jù)表明NGF是活體中交感神經(jīng)元存活的生理調(diào)節(jié)因子,。然而,，交感神經(jīng)元也對來自膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）有反應(yīng)，還有NT3,、LIF與CNTF也對其有作用,。在不產(chǎn)生GDNF或NT3的動(dòng)物中，交感神經(jīng)元會(huì)有損傷,。在離體與活體營養(yǎng)需求之間的差別或許可以用在不同環(huán)境中NGF含量和分布的不同來解釋,，培養(yǎng)中的NGF彌散在整個(gè)環(huán)境中，而在活體內(nèi)，大部分區(qū)域的含量是有限的,。因此,，NGF的重要性在于其合適的濃度。盡管在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)習(xí)慣了營養(yǎng)因子的大效應(yīng)使用量,，其他營養(yǎng)因子的協(xié)同效應(yīng)在亞優(yōu)劑量下更容易觀察到,。此外，高濃度的營養(yǎng)因子可使細(xì)胞更能抵抗毒劑以及其他壓力,。相應(yīng)的,，低濃度的營養(yǎng)因子可能用來檢查表現(xiàn)型,，例如對自由基或氨基酸的毒性刺激劑量的反應(yīng),。有許多其他的PNS培養(yǎng)系統(tǒng)只需單一營養(yǎng)因子就可使有實(shí)用價(jià)值的細(xì)胞保持在一定比例，廣為人知的有雛雞睫狀自主神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元和大鼠背根神經(jīng)節(jié)感覺神經(jīng)元,。不過,，這些模型也有局限性。例如,，培養(yǎng)中的睫狀神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元加入CNTF時(shí),，超過90%的神經(jīng)元能存活一個(gè)很長時(shí)期，但并未有跡象表明它屬于內(nèi)源的靶細(xì)胞來源的營養(yǎng)因子,，而是有爭論的相關(guān)分子,，GPA，扮演了這一角色,。大鼠背根神經(jīng)節(jié)含有好幾種細(xì)胞群體,，其中小細(xì)胞群、包括nocioceptive cell,，對NGF有反應(yīng),，但其他神經(jīng)元，例如大細(xì)胞群中的proprioception 卻對不同的神經(jīng)營養(yǎng)因子有反應(yīng),。因此,，在大多條件下培養(yǎng)物的生長并不能忠實(shí)反映親代群體的所有特性，這一問題在CNS的細(xì)胞培養(yǎng)中特別突出,，因?yàn)橐延械慕?jīng)驗(yàn)表明,，沒有一種培養(yǎng)基能適合于所有類型及亞類的神經(jīng)細(xì)胞的生長。
現(xiàn)有的證據(jù)已表明,，CNS神經(jīng)元的營養(yǎng)需求比PNS的更復(fù)雜,。對脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元與視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞神經(jīng)元的研究表明，這些神經(jīng)元與外周神經(jīng)元相比能對更為廣泛的營養(yǎng)因子起反應(yīng),。例如,，至少發(fā)現(xiàn)了15種不同的分子可在離體條件下增加神經(jīng)元的存活。而且，已觀察到運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元與視網(wǎng)膜對任何單獨(dú)的營養(yǎng)因子的存活反應(yīng),，與PNS中所觀察到的典型反應(yīng)相比,，都要小得多。因此,，大多數(shù)影響運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元及視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的營養(yǎng)因子僅僅只能支持神經(jīng)元的亞群,，而神經(jīng)元的達(dá)到一定存活要求諸多因子的結(jié)合。在視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的培養(yǎng)中,，因子的合適組合（如BDNF,、CNTF、IGF,、bFGF）包括了來自不同生長因子家族的代表,。這一結(jié)果的普遍性尚待進(jìn)一步的證實(shí)，但敲除單一的營養(yǎng)因子基因之后,，沒有表現(xiàn)出對CNS大多類群的神經(jīng)元的存活產(chǎn)生太大影響,，這一觀察與上述的事實(shí)是一致的。現(xiàn)已知少突膠質(zhì)細(xì)胞的長期存活也需要眾多營養(yǎng)因子的相互作用,。