浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州市中醫(yī)院胡勁濤等教授在知網(wǎng)發(fā)布的《補(bǔ)充腎活躍血方對(duì)去勢骨質(zhì)疏松小鼠骨-血管形成偶聯(lián)調(diào)節(jié)作用的實(shí)驗(yàn)研究》,，探討了補(bǔ)充腎活躍血方對(duì)去勢骨質(zhì)疏松小鼠骨量及骨代謝的影響,。
實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用了布魯克Micro-CT儀器，三維重建了小鼠的骨組織形態(tài)圖像,。
引言
絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松是絕經(jīng)女性的常見隱匿健康威脅,，特征為骨量減、結(jié)構(gòu)退變,，骨折風(fēng)險(xiǎn)大增,。約半數(shù)絕經(jīng)女性患病，骨質(zhì)疏松性骨折率18%～23%,，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量,。骨組織血管豐富，血管與骨形成緊密相關(guān),，絕經(jīng)后骨組織血管減少,。腎虛血瘀型多見，補(bǔ)充腎活躍血方(基于右歸飲加桃仁,、紅花)療效明顯,。
本研究用補(bǔ)充腎活躍血方醫(yī)治去勢骨質(zhì)疏松小鼠，探討其對(duì)骨-血管形成及骨代謝的影響,。
實(shí)驗(yàn)前瞻
一,、實(shí)驗(yàn)儀器：
實(shí)驗(yàn)儀器JB-P5包埋機(jī)；RM2016病理切片機(jī),；Bruker Skyscan1272三維X射線顯微成像系統(tǒng),；E100光學(xué)顯微鏡。
Bruker Skyscan1272
二,、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取50只4～5周齡SPF級(jí)健康雌性ICR小鼠,在室溫(24±2)℃,、濕度40%～60%、12 h晝夜交替照明的環(huán)境下飼養(yǎng),。
三,、動(dòng)物分組：
40只ICR小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組(10只)和去勢組(30只),。
四,、造模：
去勢小鼠造模采用舒泰80 mg/kg腹腔注射麻醉及阿托品0.04 mg/kg肌注減少氣道分泌物。麻醉完成后剃除小鼠腹部毛發(fā),，予以聚維酮消毒3次后鋪無菌巾,。取腹部正中切口，逐層切開腹部肌肉及腹膜,，沿輸卵管尋找到卵巢,，摘除卵巢,，縫合傷口。假手術(shù)模型行只切除卵巢周圍等量脂肪組織,。
五,、術(shù)后處理與分組：
去勢組小鼠行卵巢去勢手術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)8周，隨機(jī)抽取3只小鼠證實(shí)骨質(zhì)疏松造模成功后,，隨機(jī)取20 只成模小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組和中藥組,，每組各10只。
六,、給藥:
假手術(shù)組及模型組：等量生理鹽水灌胃,。
中藥組：補(bǔ)充腎活躍血方按小鼠給藥劑量換算得小鼠含生藥劑量為8.6 mg/kg，每日灌胃1次,。
七,、樣本收集:
干預(yù)8周后處死，收集樣本,。
八,、實(shí)驗(yàn)開展：
進(jìn)行Micro-CT、TRAP染色,、免疫熒光染色( EM-CN,、CD31) 、骨代謝指標(biāo)檢測,。
實(shí)驗(yàn)過程
一、Micro-CT檢測骨組織形態(tài)
小鼠處死后,，我們收集了股骨標(biāo)本,，并仔細(xì)剔除了骨組織周圍的肌肉及肌腱組織。接著,，我們使用了Bruker Skyscan1272三維X射線顯微成像系統(tǒng),，按照設(shè)定的參數(shù)(電流140 μA、電壓70 keV,、掃描厚度12 μm)對(duì)股骨遠(yuǎn)端進(jìn)行了掃描,。隨后，我們應(yīng)用了Bruker CTAn Micro-CT Software對(duì)骨組織形態(tài)進(jìn)行了分析,，重點(diǎn)關(guān)注的指標(biāo)包括：骨體積百分比(BV/TV),、小梁數(shù)量(Tb.N)以及小梁厚度(Tb.Th)。
二,、TRAP染色觀察破骨細(xì)胞數(shù)量
為了觀察破骨細(xì)胞的數(shù)量,，我們對(duì)骨組織進(jìn)行了脫鈣包埋處理，并制成了4 μm厚的石蠟切片,。接著,，我們進(jìn)行了TRAP染色,，并在顯微鏡下對(duì)破骨細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行了觀察。為了更精確地分析結(jié)果,，我們采用了Image J軟件進(jìn)行了圖像分析,。
三、免疫熒光染色觀察股骨遠(yuǎn)端干骺端CD31,、EMCN陽性表達(dá)
我們首先對(duì)石蠟切片進(jìn)行了脫蠟,、抗原修復(fù)和封閉處理。然后,，我們進(jìn)行了一抗(CD31,、EMCN)的4 ℃孵育過夜。第二天,，我們進(jìn)行了相應(yīng)的二抗孵育,，并隨后采用了DAPI染液進(jìn)行染色。在熒光顯微鏡下,，我們進(jìn)行了圖片采集,，并再次采用了Image J軟件進(jìn)行了圖像分析。
四,、骨代謝指標(biāo)檢測
為了檢測骨代謝指標(biāo),，我們收集了小鼠的腹主動(dòng)脈血液，并通過200g離心力離心5分鐘來收集血清,。接著,，我們應(yīng)用了ELISA法檢測了骨形成指標(biāo)I型前膠原氨基末端肽(PINP)和骨吸收指標(biāo)抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
一,、各組小鼠骨組織形態(tài)的比較
Micro-CT三維重建圖像顯示假手術(shù)組骨小梁較多,，模型組骨小梁明顯減少，中藥組較模型組骨小梁增加,。見圖1,。定量分析結(jié)果顯示，假手術(shù)組骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV),、骨小梁數(shù)目(Tb.N),、骨小梁厚度(Tb.Th)高于模型組和中藥組，而中藥組BV/TV,、Tb.N,、Tb.Th高于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),。見表1,。
圖1 各組小鼠脛骨Micro-CT三維重建橫斷面
表1 各組小鼠Micro-CT檢測結(jié)果比較
二、各組小鼠骨組織破骨細(xì)胞數(shù)量的比較
骨組織TRAP染色及定量分析顯示,，模型組TRAP陽性表達(dá)的數(shù)目高于假手術(shù)組和中藥組,，而假手術(shù)組TRAP陽性表達(dá)的數(shù)目少于中藥組,，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2～圖3,。
圖2 各組小鼠TRAP染色結(jié)果(×40)
圖3 各組小鼠破骨細(xì)胞定量分析比較
四,、各組小鼠股骨遠(yuǎn)端干骺端CD31、EMCN陽性表達(dá)血管比較
應(yīng)用CD31,、EMCN對(duì)股骨遠(yuǎn)端干骺端進(jìn)行熒光雙標(biāo)以檢測H血管的形成情況,，結(jié)果顯示模型組干骺端H血管的比例相比假手術(shù)組明顯減少，中藥組干骺端H血管的比例較模型組增加,，但低于假手術(shù)組,，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示補(bǔ)充腎活躍血方可以促進(jìn)去勢骨質(zhì)疏松小鼠干骺端血管的形成,。見圖4,。
圖4 各組小鼠干骺端骨組織 CD31 + EMCN 陽性面積比較
五、各組小鼠血清骨代謝指標(biāo)比較
表2 各組小鼠血清PINP,、TRACP水平比較
結(jié)果
補(bǔ)充腎活躍血方可通過促進(jìn)骨-血管形成,增加骨生成,減少骨吸收,提高去勢骨質(zhì)疏松小鼠的骨量,。
絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(PMOP)的主要癥狀為腰背疼痛、骨畸形和乏力,，中醫(yī)視其為“骨痿”“骨痹”,，認(rèn)為與腎虛血瘀有關(guān)。女子絕經(jīng)后腎精虧虛,，導(dǎo)致骨骼生長維系受影響,，形成腎虛血瘀的惡性循環(huán)。補(bǔ)充腎活躍血是醫(yī)治PMOP的重要原則,，補(bǔ)充腎活躍血方通過補(bǔ)充腎健骨,、活躍血祛瘀達(dá)到醫(yī)治效果，研究顯示它能增加去勢骨質(zhì)疏松小鼠的骨量和骨小梁數(shù)量及厚度,。
近年來，研究發(fā)現(xiàn)H型血管與骨生長密切相關(guān),，H血管減少是PMOP的危險(xiǎn)因素,。骨質(zhì)疏松女性血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)水平較低，與骨形成指標(biāo)和骨密度正相關(guān),。促進(jìn)H血管形成可以抑制破骨細(xì)胞功能,，增加骨形成，預(yù)防和醫(yī)治PMOP,。
本文內(nèi)容來源：
https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=ifIT5_n5_GcV1J_62qIHt2mBULHLQLCH4IWu6b64IT-78Jz0V-qsV_jEX9rQg4MkMVNFmmiGcMSeGcofaLVoYoFta95NF_7dxzSaw4pKVV3dVneVV9Stp1xYCEFSyzqDMOJ88t1_3boQq7t4WlNQ0GlGIknHwpDg9FafXnFJjp8J1zw64PRwHODibLrhrDzgM_vj567UCeOt8rqmHfOypw==&uniplatform=NZKPT
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