ReadyAMP^®PCR直接擴增技術(shù)應(yīng)用在細(xì)菌16s rDNA鑒定中的流程

隨著分子學(xué)的發(fā)展,，細(xì)菌16S rDNA序列的鑒定逐漸成為細(xì)菌特征的“金標(biāo)準(zhǔn)”,。大部分實驗室中正逐步使用該方法替代傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng),、生化鑒定等方法,。16S rDNA因其序列在物種間的高度多樣性,，成為細(xì)菌分類研究的“分子鐘”,，素有“細(xì)菌化石”之稱,。

16S rDNA鑒定意義重大,，主要體現(xiàn)在以下幾個方面：

1、測序結(jié)果和已知細(xì)菌16S rDNA序列數(shù)據(jù)庫進行比較,，可以確定未知細(xì)菌的分類和物種關(guān)系,。對臨床微生物和環(huán)境微生物意義重大。

2,、通過比較不同細(xì)菌的16S rDNA序列,，可以推測相互之間的親緣關(guān)系和進化關(guān)系，進而了解細(xì)菌的進化和演化史,。

3,、通過環(huán)境樣本中細(xì)菌16S rDNA序列比較，可以分析和總結(jié)出不同細(xì)菌在不同環(huán)境下對自然界的功能和作用,。

4,、菌落中16S rDNA可變區(qū)進行鑒定，可提供菌落組成,、表達豐度,、以及系統(tǒng)進化分析。為菌落與環(huán)境,、環(huán)境與人類的相互作用提供數(shù)據(jù)支持,。

但是常規(guī)獲得16S rDNA序列的方法如圖1。實驗室工作人員zui常用的細(xì)菌DNA提取試劑盒,，也就是通用的離心柱式提取基因組

圖1 傳統(tǒng)離心柱提取和ReadyAMP®快速16S rDNA細(xì)菌鑒定試劑盒對比

DNA,。作為傳統(tǒng)且經(jīng)典方法，該方法對長期從事提取工作的實驗室人員來說存在幾個難點：

1,、提取時間長達40-90分鐘

2,、需要使用溶菌酶、蛋白酶K等酶類

3,、需要使用多種設(shè)備,，包括恒溫浴、離心機等

4,、革蘭氏陽性菌產(chǎn)量低

針對以上痛點和難點,，我司開發(fā)了ReadyAMP^®快速16S rDNA細(xì)菌鑒定試劑盒,，操作流程見圖1,。該方法最大的特點如下：

1、簡單便捷,、一步完成,；

2、檢測線低至10⁴個/mL細(xì)菌,；

3,、檢測樣本豐富,，例如對數(shù)生長期菌液、菌斑,、甘油菌等,；

4、樣本需求量低,，例如菌液/甘油菌1-3μL,、菌斑1個；

5,、革蘭氏陰性菌檢出,；

6、革蘭氏陽性菌99.99%檢出,；

7,、難培養(yǎng)樣本有效；

8,、珍貴樣本有效,；

已驗證的細(xì)菌包括：

案例A——對數(shù)生長期細(xì)菌快速擴增16S rDNA

以對數(shù)生長期菌液為模板，使用ReadyAMP^®快速16S rDNA細(xì)菌鑒定試劑盒（貨號Nu-16S01）擴增16S rDNA,，以菌液對應(yīng)硅膠柱提取基因組為對照,。

案例B——單菌落快速擴增16S rDNA

以對單菌置生理鹽水中為模板，使用ReadyAMP^®快速16S rDNA細(xì)菌鑒定試劑盒（貨號Nu-16S01）擴增16S rDNA,，以菌液對應(yīng)硅膠柱提取基因組為對照,。