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SPET技術助力歐盟茄科種質(zhì)庫的基因分型
G2P-SOL項目是一個歐盟資助的茄科作物項目,，匯集了歐洲和國際上主要的種質(zhì)庫，其中包括馬鈴薯,、番茄、胡椒和茄子這四種主要茄科作物的種質(zhì)資源,。在該項目中,，已對包括野生近緣種在內(nèi)的約 5,900 個茄子種質(zhì)進行了收集。 為了獲得約 3,500 個代表性種質(zhì)的基因組信息,，該項目設計了一組定制的 5K SNP位點的SPET 技術探針（單引物富集技術,，Nugen），這些SNP位點均勻分布在整個基因組,，并且SNP位點主要位于基因豐富的區(qū)域,。 DNA 樣本由基因庫提供，而文庫制備和 illumina 高通量基因測序由 IGA Technology 公司提供服務,。測序數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)量過濾后,，使用 BWA-MEM 將reads與茄子參考基因組序列（4.1 版）比對，并使用 GATK-4.1.9軟件進行 SNP 分析,。通過刪除具有低覆蓋測序數(shù)據(jù)的種質(zhì),，保留了 3,412 個，并通過應用嚴格的質(zhì)量標準確定了 120K 多態(tài)位點,。其中,，4306個多態(tài)位點為5K SPET探針組靶向的SNP，其余為輔助脫靶SNP,。 這些確認的SNP位點為為識別錯誤標記的種質(zhì)（即錯誤的物種識別）和基因庫內(nèi)及不同基因庫之間的重復的物種記錄提供了重要信息,。此外，SPET技術可用于建立篩選實驗流程以避免不同地域進行重復的種質(zhì)資源保護,。 研究茄子種質(zhì)間的種群結(jié)構(gòu)和遺傳關系可為全基因組關聯(lián)分析（Genome wide association study,，GWAS）建立核心種質(zhì)庫。此外,，基于基因庫中可用的歷史表型數(shù)據(jù),，可確定與關鍵性狀相關的位點。 實驗結(jié)果表明,，SPET 技術可作為簡化基因組測序和基因芯片的替代方法,，是一種可適用于高通量基因分型、管理和增強基因庫收藏的有效工具,。
SPET 技術背景介紹：
單核苷酸多態(tài)性 (SNP) 是真核生物基因組中豐富的序列變異類型,，并且已成為廣泛使用的基因分型標記,。 基因分型方法依賴于不同的技術，包括高通量測序NGS,、基因芯片和聚合酶鏈式反應 (PCR),。目前，常用的高通量 SNP 發(fā)現(xiàn)和基因分型方法是基于簡化基因組測序 (RRS)手段的高通量基因分型測序(GBS,，Genotyping by Sequencing)方法,，其中大多數(shù)是基于限制性內(nèi)切酶的使用來片段化基因組，通過對這些酶切DNA序列來測序來替代全基因組測序,，從而達到基因分型目的,。 GBS技術的一個主要限制是限制酶位點并不是在基因組上隨機分布的，因此無法在基因內(nèi)靶向定位或定位在具有功能意義的分子標記,。
Nugen公司（現(xiàn)Tecan Genomics公司）開發(fā)了單引物富集技術,，這是一種可定制的靶向測序的解決方案，且經(jīng)濟實惠,。 SPET技術通過已有的參考基因組或轉(zhuǎn)錄組信息以及需要驗證的靶向SNP組來進行探針設計,。 SPET 探針長約 40bp，探針設計為與包含SNP的相鄰DNA序列,，因此能夠檢測目標SNP并發(fā)現(xiàn)目標周圍其他的SNP,。SPET最初是應用于醫(yī)學領域，多篇Nature文獻都有報道,。由于單引物富集相對于PCR引物設計具有更高的靈活性,，2019年Scaglione等人在歐盟的項目中把該技術應用在植物分子育種的研究中，評估了SPET技術對玉米和黑楊的基因分型應用,。SPET同樣可應用于種質(zhì)集的基因分型,。外顯子的保守序列應有助于在這些區(qū)域上設計的 SPET 探針來研究不同相關物種之間的雜交，從而提高發(fā)現(xiàn)新 SNP 的機會,，特別是如果探針下游區(qū)域位于保守性較低的區(qū)域,，如內(nèi)含子和非翻譯區(qū)域 UTR。
