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Allegro高通量靶向SNP組測序技術(shù)助力野生動物基因分型
在野生動物的研究中，應(yīng)用基因組學(xué)技術(shù)的主要困難之一是常規(guī)采集微量或非創(chuàng)傷性樣本，這些樣本通常會發(fā)生降解片段化,、含量極低或有環(huán)境或食糜的外源 DNA 污染的情況發(fā)生。在野生動物采樣場景中,，糞樣是相對較容易采集的,，特別適合避免在接觸動物有危險性的情況下進行采樣。以往,，由于缺乏靈活且經(jīng)濟的技術(shù)手段，使得對糞便樣本的基因組分析受到限制,。
在過去的幾十年里,，微衛(wèi)星（SSR）分析是野生動物遺傳學(xué)基因分型的傳統(tǒng)技術(shù)。雖然微衛(wèi)星分析仍被廣泛使用,，但微衛(wèi)星分析正迅速被單核苷酸多態(tài)性 (SNP) 分析所取代,，因為單核苷酸多態(tài)性 (SNP) 在整個基因組中更為豐富，并且更適合于自動化的高通量基因分型,。高通量的SNP組已通過基因芯片的方式廣泛用于人類和農(nóng)業(yè)物種的研究,。 然而，高通量 SNP 基因芯片的高昂開發(fā)成本限制了它們在野生動物研究中的使用,，僅限于少數(shù)物種,。 SNP 基因芯片也不適用于微量樣本,，因為它們通常需要大量 DNA。
高通量測序基因分型 (GBS) 技術(shù)規(guī)避了基因芯片開發(fā)成本高的問題,，但酶切位點序列的隨機分布阻止了靶向測序特定位點,，而且大多數(shù)高通量測序基因分型 (GBS)技術(shù)還需要模板 DNA的起始量高于實際的微量樣本，例如糞便樣本,。
隨著基因芯片和 GBS高通量測序技術(shù)的發(fā)展,，高通量靶向SNP組測序方法已成為從全基因組序列中獲得基因型數(shù)據(jù)的可行替代方案。 高通量靶向SNP組測序可大致分為1）探針序列捕獲方法,，其中探針被設(shè)計為捕獲 DNA 的誘餌,，或2）通過 PCR 方法，其中探針被設(shè)計用于目標(biāo)序列擴增,。 高通量靶向SNP組測序?qū)崿F(xiàn)了微量DNA模板的目標(biāo)SNP位點的高覆蓋率和低測序成本,。 因此， 高通量靶向SNP組測序有望將野生動物遺傳學(xué)領(lǐng)域引入基因組學(xué)研究,。
最近,，一種Allegro的新型高通量SNP組靶向測序試劑已顯示出成本低、測序數(shù)據(jù)質(zhì)量高和通量高的基因分型優(yōu)勢,。 該試劑通過單引物富集技術(shù) (SPET),，可以在單個反應(yīng)中進行1k – 100k + 目標(biāo)位點的多重目標(biāo)序列的富集，推薦的最小 DNA起始量為 10ng,。 單引物擴增減少了引物二聚體的出現(xiàn),，對SNP靶位點的高特異性進一步提高了實驗之間的可重復(fù)性。 與基因芯片相比,，這種方法很靈活,，允許對相對少量的樣本（目前為 192 個的試劑包裝）進行快速定制分析設(shè)計。單引物富集技術(shù) (SPET)起初用于人類醫(yī)學(xué),，然后用于植物遺傳學(xué),，包括黑楊和玉米、番茄和茄子,、棕櫚油和加那利群島的瀕危植物,，但它在野生動物中的使用仍然有限。
在大型哺乳動物中,，糞便通常是最容易獲得的用于基因分型的樣本組織。 值得注意的是,，馬科動物的糞便中積累大量上皮細(xì)胞沉積物，從而使得從黏膜表面采樣宿主DNA提供了可能,。
日前,，加拿大科學(xué)家報道了使用Allegro高通量SNP組靶向測序試劑從野馬糞便拭子中分離的DNA生成全基因組 SNP 數(shù)據(jù)的研究,。作為加拿大某省野馬長期研究的一部分，分別使用 dsDNA 熒光和宿主特異性 qPCR 測定法對收集的 989 份樣品的總DNA和宿主特異性 DNA進行了定量,。使用針對 279個SNP的定制SNP組探針對代表 44個個體的 48個樣本進行了基因分型,，這些樣本至少含有 10ng 的宿主 DNA。通過將 Allegro高通量SNP組靶向測序基因型與從具有SNP基因芯片的相同個體和來自同一匹馬的多個樣本中獲得的基因型進行對比,，分別評估了基因分型的準(zhǔn)確性和一致性,。 62% 的拭子產(chǎn)生了可用于Allegro高通量SNP組靶向測序技術(shù)的起始宿主DNA 量。忽略未能擴增的樣本,，Allegro高通量SNP組靶向測序試劑對每個樣本平均恢復(fù)了 86.7% 的目標(biāo)SNP位點,，而Allegro高通量SNP組靶向測序技術(shù)和 基因芯片之間的基因型一致性為 98.5%。來自同一個體的基因型的重復(fù)性接近統(tǒng)一,，平均為 99.9%,。該研究表明Allegro高通量SNP組靶向測序試劑適用于全基因組、微量DNA樣本的靶向 SNP 基因分型,，并將促進馬科動物和相關(guān)物種的進一步生態(tài)和保護遺傳學(xué)研究,。