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細胞凋亡形態(tài)學檢測方法

細胞凋亡的早期形態(tài)學改變是核染色質(zhì)濃聚,、固縮,聚集在核膜周邊,，然后是胞漿濃縮、胞膜起泡,繼而細胞核裂解成若干碎片,，細胞膜將胞質(zhì)和染色質(zhì)斷片包裹,，胞漿內(nèi)形成多個膜結(jié)構(gòu)尚完整的“小泡”及 “凋亡小體” (apoptoticbody)。這不同于細胞壞死的細胞腫脹,、胞膜破裂,、細胞崩解,。
       根據(jù)凋亡細胞固有的形態(tài)特征,，至今為止，已經(jīng)設(shè)計了許多不同的細胞凋亡形態(tài)學檢測方法,。
 

 鏡像綺點依靠多年在細胞培養(yǎng)方面的積累,，為客戶提供完整的細胞CRO解決方案。根據(jù)客戶需求,，直接在細胞水平進行藥物或者試劑的刺激,，觀察細胞狀態(tài)的變化或者特定通路上mRNA或蛋白的變化，也可以先制作動物模型,，對動物進行處理后,，分離特定的原代細胞進行需要的檢測。

    同時,，我們可以依照客戶提供的具體實驗方案進行操作,，也可以根據(jù)客戶要求進行實驗設(shè)計,，并根據(jù)客戶實驗的規(guī)模和難度提供詳細的報價和實驗周期規(guī)劃。

       一,、光學顯微鏡觀察

       凋亡細胞的主要特征為核染色質(zhì)致密深染,，形成致密質(zhì)塊，有時可碎裂,。在HE染色的組織切片中細胞體積縮小,，胞質(zhì)致密、嗜酸性染色增強,，并可形成凋亡小體,。在組織中凋亡細胞常以分散單個形式存在，凋亡細胞與周圍細胞分離,，不引起炎癥反應(yīng),。
本方法簡便易行，但在細胞密集的組織中對于改變不典型的細胞判斷較困難,，常缺乏較為特征的指標,，具有較強的主觀性，重復(fù)性差,。本方法可用于調(diào)亡現(xiàn)象的初步觀察,，作為分析指標之一。
       檢測方法：細胞涂片或組織石蠟切片作HE染色或Giemsa染色,，在高倍物鏡下觀察凋亡細胞的形態(tài)改變,，結(jié)合顯微測量工具可作凋亡細胞計數(shù)。
       二,、視頻時差顯微技術(shù)
       此方法用于細胞培養(yǎng),，通過相差顯微鏡可動態(tài)觀察細胞凋亡的變化過程，尤其是觀察細胞表和外形的變化,。凋胞與基質(zhì)分離,，胞體變圓、收縮,、出泡,，有的細胞拉長，出現(xiàn)釘狀突起,，特續(xù)數(shù)小時后細胞膜破裂,，細胞溶解，通過連續(xù)觀察,，本方法可養(yǎng)壑培養(yǎng)中的凋亡細胞,，但不能用于病理組織。
       檢測方法：收集2×105細胞/ml培胞,，置于多孔培養(yǎng)板,，加入凋亡誘導(dǎo)劑,，在帶有自動攝像裝置的相差顯微鏡下觀察凋亡細胞的動態(tài)改變，每隔分鐘30秒作序列攝影,，連續(xù)24小時,。如同進進行熒光染色，可參熒光晃微鏡下觀察和攝影,。
       三,、電子顯微鏡觀察

雖然光學顯微鏡下可以看見胞膜起泡現(xiàn)象和凋亡小體,但凋亡細胞的形態(tài)學變化大多發(fā)生在超微結(jié)構(gòu),因此用光鏡觀察難以令人滿意,而透射電鏡可清楚地觀察到細胞結(jié)構(gòu)在凋亡不同時期的變化。電鏡形態(tài)學觀察是迄今為止判斷凋亡經(jīng)典,、可靠的方法,被認為是確定細胞凋亡的金標準,。

       缺點：
       (1)只能定性,不能定量;
       (2)標本處理過程復(fù)雜,設(shè)備相對昂貴,對檢查者的技術(shù)水平要求較高,不適于大批標本檢測;
       (3)在組織切片上進行電鏡觀察時,有時凋亡很難與正常細胞有絲分裂相鑒別,因為兩種情況下都可出現(xiàn)染色質(zhì)濃聚。如同時進行熒光染色,可彌補電鏡檢查的不足,。
       檢測方法：透射電鏡標本經(jīng)戊二醛和餓酸雙重固定,，丙酮脫水，環(huán)氧樹脂包埋,，超薄切片,，醋酸枸椽酸電子又重染色，透射電鏡觀察,。掃描電鏡標本經(jīng)戊二醛和餓酸雙重固定,，乙醇逐級脫水，CO2臨界點干燥,，真空噴金,，掃描電鏡觀察。
       四,、流式細胞技術(shù)
       流式細胞儀檢測凋亡細胞是通過檢查其光射特征及熒光參數(shù)時行的,。細胞穿過流式細胞儀的激光束集點時使激光發(fā)生散射，分析散射光可以提供細胞大小及結(jié)構(gòu)的信息,。散射光包括前向散射光和左向角散射光兩種,，前向散射光的強度與細胞大小、體積相產(chǎn),，右向角射光的強度與細胞結(jié)構(gòu)的析射性,、顆粒性（granu-larity）有關(guān),。

細胞凋亡形態(tài)學檢測方法
       細胞凋亡過程中出現(xiàn)的形態(tài)改變?nèi)缂毎櫩s,、胞膜起泡、核濃縮和碎裂等可以使光散射特性發(fā)生改變,。早期凋亡細胞主要表現(xiàn)為前向散射光減弱而右向角散射光增強或不變,，前者反映了細胞的皺縮，后者反映了細胞的核逐縮及碎裂,。晚期凋亡細胞的前向散射光和右向角散射光均減弱,。
       由于光散射牧場生并非凋亡細胞的特異性指標,，細胞的機械性損傷和細胞壞死也可以使前向散射光減弱。因此,，只有將光散射特性的檢測與熒光參數(shù)的檢測結(jié)合起來才能準確地辨認凋亡細胞,。
       細胞凋亡過程中核酸內(nèi)切酶在DNA分子核小體間的降解，導(dǎo)致小分子DNA漏出,，核DNA含量下降,，細胞熒光染色后作流式細胞儀分析，可以發(fā)現(xiàn)在DNA直方圖上正常二倍體細胞的Go/G1峰前出現(xiàn)一個亞二倍體峰（xub-G1峰,，即AP峰--apoptotic peak）,代表凋亡細胞,。
       根據(jù)此亞二倍體峰可以計算凋亡細胞的百分率。此外,，流式細胞術(shù)還可以通過測定線粒體膜的電位,、溶酶體質(zhì)子泵的活性及細胞DNA/總蛋白質(zhì)比例等方法辨認凋亡細胞。
       檢測方法：獲取密度1×106細胞/ml左右的細胞懸液,，精洗,，固定，熒光染料染色,，上流式細胞儀分析,。                                     

一站式細胞解決方案

    針對基礎(chǔ)及臨床研發(fā)中的原代細胞和iPS細胞的實驗，由于原代細胞的分離和培養(yǎng)難度大,，iPS細胞制作和分化的實驗操作復(fù)雜,，除長期進行原代和iPS培養(yǎng)工作的實驗室，想要獲得足夠量的狀態(tài)好的細胞比較困難,。

服務(wù)流程：

    1.聯(lián)系我們,，溝通客戶實驗計劃及目標，評估實驗的的可行性,。    

    2.依照客戶要求,，設(shè)計相應(yīng)的實驗；或客戶已有實驗方案發(fā)送給我們,，我們研究方案的可操作性,。    

    3.確定終的實驗方案，報價和周期,。    

    4.簽訂服務(wù)合同,，支付預(yù)付款。    

    5.開始實驗服務(wù),，并定期向客戶反饋和交流,。    

    6.實驗完成，提供完整實驗說明和部分實驗結(jié)果。    

    7.支付尾款,，向客戶提供完整的全部實驗報告和原始數(shù)據(jù),。    

    8.項目完成。