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MTT檢測法,，是一種檢測細胞存活和生長增殖的方法,。
檢測原理：活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚(Formazan)并沉積在細胞中，而死細胞無此功能,。二甲基亞砜(DMSO )能溶解細胞中的甲瓚,，用酶標儀在490nm波長（或其他波長）處測定其光吸收值，在一定細胞數(shù)量范圍內(nèi)，MTT結晶形成的量與細胞數(shù)成正比,。根據(jù)測得的吸光度值(OD值),，來判斷活細胞數(shù)量，OD值越大,，細胞活性越強(如果是測藥物毒性,，則表示藥物毒性越小)。
該方法靈敏度高,、經(jīng)濟實用,，已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模藥物篩選,、細胞毒性試驗以及細胞放射敏感性測定等等,。

MTT主要有兩個用途：（1）藥物（也包括其他處理方式如放射線照射）對體外培養(yǎng)的細胞毒性的測定；（2）細胞增殖及細胞活性測定,。

MTT法細胞活性檢測

MTT方法能簡單,、快捷、準確地測定細胞的增殖反應,，并且其價格低廉,，成為日前各實驗室檢測細胞活性的shou選方法之一。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中,，而死細胞無此功能,。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，用酶標儀在490nm波長處測定其光吸收值,，在一定細胞數(shù)范圍內(nèi),，MTT結晶形成的量與細胞數(shù)成正比。根據(jù)測得的吸光度值（OD值）來判斷活細胞數(shù)量,，OD值越大,，細胞活性越強（如果是測藥物毒性，則表示藥物毒性越?。?。

一、MTT 溶液的配制

1,、MTT 溶液的配制通常MTT 配成的終濃度為5mg/ml,，須用PBS或生理鹽水做溶劑。

市面上一般MTT的包裝為100mg,，250mg或1g,。對于100mg這樣的小包裝，廠家都是將MTT放入小管中的,，個人建議不要再用天平稱量分裝,，而應該一次性將其全配制成溶液,，如100mg用20mlPBS來溶解。具體做法：預先在50ml離心管（沒有的話,，可用培養(yǎng)瓶替代）加入20ml PBS,，從中先吸取500-1000ul PBS裝入含MTT的小管中，吹打若干次后將其移入50ml離心管,，然后再混勻,。可以重復幾次,，以使小管中的MTT不殘留于管內(nèi),。將MTT*混勻后，用0.22μm濾膜過濾以除去溶液里的細菌,，分裝避光(避光袋或是黑紙,、錫箔紙包住)可長期保存于-20℃。按細胞培養(yǎng)板每孔需加10ul計算,，一般每96孔板約需1ml,，所以分裝時可考慮每管分裝1ml。對于大包裝,，可按上述方法稱取一部分溶解，也有人將粉劑分裝在EP管里,，用的時候現(xiàn)配,，直接往培養(yǎng)板中加。

2,、注意事項：

（1）在配制和保存的過程中,，容器用鋁箔紙包住。

（2）配成的MTT需要無菌,，MTT對菌很敏感,。

（3）MTT一般現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后4℃避光保存兩周內(nèi)有效,，或配制成5mg/ml保存在-20度長期保存,，避免反復凍融，小劑量分裝,，用避光袋或是黑紙,、錫箔紙包住避光以免分解。當MTT變?yōu)榛揖G色時就不能再用,。

（4）MTT有致癌性,，使用時需小心。

MTT法細胞活性檢測

二,、MTT甲瓚溶解液

1,、二甲基亞砜DMSO：可以直接溶解，無需配制，使用方便,，溶解速度快,，但對人體毒性較大，且需去除原培養(yǎng)液,，在去除培養(yǎng)液的過程中,，可能會把結晶去掉，導致結果不穩(wěn)定,。

2,、三聯(lián)溶解液：SDS10g，異丁醇5ml,，10M HCl 0.1ml,，用雙蒸水溶解配成100ml溶液，該溶解液不需去除原培養(yǎng)基,，但溶解較慢,。該溶解液因含有SDS，在低溫保存的時候易產(chǎn)生結晶,，因此在用之前必須提前幾小時拿至室溫,，將SDS結晶全部溶解后再使用。

三,、MTT法實驗步驟

1,、yi酶消化對數(shù)期細胞，終止后離心收集,，制成細胞懸液,，細胞計數(shù)調(diào)整其濃度至5-10×104/ml。

2,、將細胞懸液制備好后,，輕輕混勻，每孔加入100ul, 這樣待測細胞的密度為5000—10000/孔（邊緣孔用無菌PBS填充）,。

注意：因細胞在混勻后仍要繼續(xù)沉降,，因此接種的過程中要反復多次混勻，如每加6個孔就混勻一次,，以確保接種的細胞密度在各孔之間*相同,，這對于MTT的結果至關重要。

3,、將接種好的細胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng),，至細胞單層鋪滿孔底（96孔平底板），加入濃度梯度的藥物,。原則上,，細胞貼壁后即可加藥（兩小時——半天時間）,，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥,。一般5-7個梯度,，每孔100ul，設3-5個復孔,，建議設6個,，否則難以反應真shi情況。

注意：對于加藥,，有人直接將藥物按不同體積加入到96孔板中,，以形成濃度梯度。但本人認為應盡量在EP管中將不同濃度的藥物配好,，然后將96孔板中的培養(yǎng)上清去掉（可以用排槍吸走）再加入100ul含不同濃度藥物的培養(yǎng)基,，這樣能保證藥物濃度的準確。另外,，需注意的是,，如果用這種方法，不要把96孔板的培養(yǎng)液全部吸走后再加藥,，應該吸完一部分后立即加樣,，避免由于96孔板干燥引起細胞死亡。

4,、5%CO2,，37℃孵育16-48h，倒置顯微鏡下觀察藥物的作用效果,。

5、每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml,，即0.5%MTT）,，繼續(xù)培養(yǎng)4h。

6,、終止培養(yǎng),，準備溶解結晶。

溶解結晶的方法有兩種,，用DMSO溶解：

1)用DMSO溶解： MTT加入培養(yǎng)4h后,，結晶可充分形成。將上清去掉,，該過程要注意不能把Formazan結晶移走,。有人直接用移液器將上清移走，也有人建議先鋪幾張濾紙在桌面,，然后將96孔板輕輕倒置,，這樣上清便被濾紙吸走,，以減少結果的損失。

2) 每孔加入150ul二甲基亞砜,，置搖床上低速振蕩10min,，使結晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值,。

另一種方法,，用三聯(lián)溶解液：

1) MTT加入培養(yǎng)4h后，結晶可充分形成,。這種方法細胞上清可以不用去掉,，直接在每孔加入100ul溶解液。（該溶解液因含有SDS,，在低溫保存的時候易產(chǎn)生結晶,，因此在用之前必須提前幾小時拿至室溫，將SDS結晶全部溶解后再使用,。）

2) 放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4—6小時,，鏡下觀察，待結晶全部溶解后570nm測吸光度,。通常37℃孵育4小時左右,，紫色結晶會全部溶解。如果紫色結晶較小較少,，溶解的時間會短一些,。如果紫色結晶較大較多，溶解的時間會長一些,。

7,、同時設置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT,、二甲基亞砜）,，對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì),、培養(yǎng)液,、MTT、二甲基亞砜）,。

四,、MTT結果分析

關于如何計算IC50 ——改良寇式法:lgIC50=Xm-I[P-(3-Pm-Pn)/4]

Xm：lg 大劑量

I：lg(大劑量/相臨劑量)

P0：陽性反應率之和

Pm：大陽性反應率

Pn：小陽性反應率