人臍靜脈細(xì)胞HUVEC是從臍帶組織中分離出來的；它是臍帶的重要結(jié)構(gòu)細(xì)胞之一,，在人體的正常生理過程中發(fā)揮著重要作用,。臍帶是連接哺乳動(dòng)物的胎兒和胎盤的管狀結(jié)構(gòu)。臍帶中穿過尿道膜的血管是臍動(dòng)脈和臍靜脈,，卵黃囊中的血管是臍腸系膜動(dòng)脈和臍腸系膜靜脈,。在子宮內(nèi)，來自胎盤母親部分的子宮動(dòng)脈的毛細(xì)血管與胎盤女兒部分的胎兒毛細(xì)血管接近,，母親和胎兒的血液在這里進(jìn)行二氧化碳和氧氣的交換,，代謝物是代謝廢物和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。臍動(dòng)脈將胎兒產(chǎn)生的廢物輸送到胎盤,，而臍靜脈將O2和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)從胎盤輸送到胎兒體內(nèi),。
人臍靜脈細(xì)胞HUVEC是通過胰蛋白酶膠原酶聯(lián)合消化法結(jié)合差異化粘附法制備的，并在內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基中進(jìn)行了培養(yǎng)和篩選。細(xì)胞總數(shù)約為5×10^5個(gè)/瓶,；細(xì)胞經(jīng)CD31/vWF免疫熒光鑒定,，純度達(dá)90%以上，無HIV-1,、HBV,、HCV、支原體,、細(xì)菌,、酵母和真菌。
人臍靜脈細(xì)胞HUVEC的實(shí)驗(yàn)步驟
1,、將15-20cm長(zhǎng)的新生兒臍帶放入無菌PBS溶液中保存,。(注意：在4℃下最多可保存24小時(shí)，室溫下可保存6小時(shí),，否則將被丟棄）,。
2、將鈍針插入臍靜脈管,，用無菌PBS液沖洗3-5次,，直至污染的血液干凈。
3,、用手術(shù)鉗夾住臍帶下端,，加入15ml膠原酶（1mg/ml）在室溫下消化15-20分鐘，并不時(shí)上下?lián)u晃臍帶,。
4,、消化結(jié)束后，松開下面的手術(shù)鉗,，將消化液流入50ml無菌離心管,，用無菌PBS溶液沖洗臍帶2-3次。
5,、將收集的溶液離心（2000rpm）3分鐘,。
6、取出上清液,，加入10mlM199培養(yǎng)基（加入10U/ml的bFGF）,，用肘部吹去細(xì)胞，將所有液體轉(zhuǎn)移到用明膠包裹的培養(yǎng)瓶中,，在37℃下培養(yǎng)（注：每個(gè)培養(yǎng)瓶中加入3-4ml無菌1%明膠溶液,，搖勻使明膠溶液*覆蓋瓶底，37℃下培養(yǎng)至少2小時(shí),。使用前倒掉明膠溶液,。明膠涂層有利于細(xì)胞壁的粘附）,。
7、培養(yǎng)24小時(shí)后,，倒出培養(yǎng)基,，用無菌PBS溶液洗2-3次，洗去紅細(xì)胞和死細(xì)胞,，加入10ml新鮮M199培養(yǎng)基,。
8、每2天更換一次培養(yǎng)基（每次更換2/3的培養(yǎng)基）,。
9,、一般來說，經(jīng)過5-7天的培養(yǎng),，細(xì)胞可以生長(zhǎng)到80-90%的單層,，可以傳代。
10,、人臍靜脈細(xì)胞HUVEC倒出培養(yǎng)基,，用無菌PBS溶液洗2-3次，加入2-3毫升消化液（0.25%胰蛋白酶+0.1%EDTA）消化細(xì)胞,，在顯微鏡下觀察,。一旦細(xì)胞變圓，加入2-3次含血清的DMEM培養(yǎng)基以停止反應(yīng),。
11,、用肘部吹干細(xì)胞，將消化后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到50ml無菌離心管中,，2000rpm,，離心3分鐘。
12,、倒出上清液,，加入10毫升新鮮培養(yǎng)基。一般來說,，3-4瓶細(xì)胞可以在一個(gè)瓶子里進(jìn)行傳代培養(yǎng),，然后像這樣進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
13,、一般來說，通過2-3代（約20天）進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn),。
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