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　　一,、人表皮永生化細胞HACAT的培養(yǎng)步驟：

　　1、細胞復(fù)蘇：將含有1ml細胞懸液的冷凍管在37℃水浴中搖晃解凍,，加入5ml培養(yǎng)基混勻,。1000rpm離心5分鐘，棄上清,，加入4-6ml*培養(yǎng)基吹勻,。然后，將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中過夜培養(yǎng)（或?qū)⒓毎麘乙杭尤?cm培養(yǎng)皿中）培養(yǎng)過夜,。第二天,，更換液體并檢查細胞密度。

　　2,、細胞傳代：當細胞密度達到80%-90%時,，可進行傳代。
 

　　二,、貼壁細胞可采用以下方法傳代：

　　1,、棄去培養(yǎng)上清液，用不含鈣鎂離子的PBS洗滌細胞1-2次,。

　　2,、在培養(yǎng)瓶中加入1-2ml消化液，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min,，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況,。如果大部分細胞變圓脫落，迅速將其放回控制臺,，輕敲培養(yǎng)瓶數(shù)次,，然后加入5ml以上含10%血清的*培養(yǎng)基終止消化。

　　3,、輕輕吹打細胞,，待*脫落后吸出，1000rpm離心8-10分鐘,，棄上清,，加1-2ml培養(yǎng)基吹勻,。

　　4、按5-6ml/瓶加入培養(yǎng)液,，將細胞懸液按1：2～1：5的比例分裝到裝有5-6ml培養(yǎng)液的新皿或瓶中,。

　　

　　三、對于懸浮細胞,，可采用以下方法進行傳代：

　　方法1：收集人表皮永生化細胞HACAT,，1000rpm離心8-10分鐘，棄上清,，加1-2ml培養(yǎng)基吹勻,。將細胞懸液按1:2至1:5的比例分入裝有8ml培養(yǎng)基的新培養(yǎng)皿或瓶中。

　　方法2：換一半介質(zhì)即可,。棄去一半培養(yǎng)基后,，將剩余的細胞懸浮，將細胞懸浮液以1:2至1:3的比例分裝到裝有8ml培養(yǎng)基的新皿或瓶中,。

　　三,、細胞冷凍保存：細胞生長良好時可進行冷凍保存。貼壁細胞冷凍后棄去培養(yǎng)基加入少量胰蛋白酶,。細胞變圓脫落后,，離心收集。將它們以1000rpm離心8-10分鐘以去除上清液,。根據(jù)冷凍量加入血清和DMSO,。冷凍比例為90%FBS+10%DMSO。

　　PS：如果客戶收到2ml管狀細胞人表皮永生化細胞HACAT,，收到細胞后,，用75%酒精噴灑整管消毒，放入超凈臺或安全柜,，嚴格無菌操作,；將管狀細胞轉(zhuǎn)移到T25培養(yǎng)瓶或6cm培養(yǎng)皿中，加入*培養(yǎng)基約5ml,，混勻,，放入培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，然后檢查細胞密度：如果密度不超過80%,，換溶液以繼續(xù)培養(yǎng),、繼代培養(yǎng)或酌情冷凍。如果密度超過80%,，可以直接通過（方法同上）,。