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細胞轉(zhuǎn)染的類型及方法

閱讀:3873      發(fā)布時間:2017-10-9
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轉(zhuǎn)染(Transfection)是指將DNA或者RNA導入真核細胞中的過程。轉(zhuǎn)染的目的是產(chǎn)生重組蛋白,,或特異性增強或抑制轉(zhuǎn)染細胞中的基因表達,。細胞轉(zhuǎn)染有哪些類型和方法呢?

1)根據(jù)導入的核酸存在于宿主細胞的時間長短,,可以分為瞬轉(zhuǎn)和穩(wěn)轉(zhuǎn),。
       

瞬轉(zhuǎn)

穩(wěn)轉(zhuǎn)

導入的DNA沒有整合到基因組中,而是保留在細胞核上

導入的DNA整合到基因組中

導入的遺傳物質(zhì)不傳遞到子代,; 遺傳改變只是暫時的

導入的遺傳物質(zhì)能夠代代相傳,;遺傳改變是*的

不需要選擇性篩選

需要選擇性篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞

DNA載體和RNA都可用于瞬時轉(zhuǎn)染

只有DNA載體可用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染;RNA本身不能穩(wěn)定地導入細胞中

導入的遺傳物質(zhì)的高拷貝數(shù)導致高水平的蛋白質(zhì)表達,。

單拷貝數(shù)或低拷貝數(shù)的穩(wěn)定整合的DNA導致較低水平的蛋白質(zhì)表達,。

通常在轉(zhuǎn)染后24-96小時內(nèi)收獲細胞。

需要2-3周的時間篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞克隆,。

通常不適合使用具有誘導型啟動子的載體的研究,。

適用于使用帶有誘導型啟動子的載體的研究。

       2)根據(jù)轉(zhuǎn)染方式可以分為化學,,生物,,物理方法。
        

轉(zhuǎn)染類型

轉(zhuǎn)染方法

原理

應用

特點

化學轉(zhuǎn)染法

磷酸鈣法

磷酸鈣DNA復合物吸附細胞膜被細胞內(nèi)吞

穩(wěn)轉(zhuǎn),,

瞬轉(zhuǎn)

不適用于原代細胞,,操作簡便但重復性差,有些細胞不適用

陽離子
脂質(zhì)體法

帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負電的磷酸基團形成復合物被細胞內(nèi)吞

穩(wěn)轉(zhuǎn),,

瞬轉(zhuǎn)
所有細胞

適用性廣,轉(zhuǎn)染效率高,,重復性好,,但轉(zhuǎn)染時需除血清。轉(zhuǎn)染效果隨細胞類型變化大

DEAE-右旋糖苷法

帶正電的DEAE-右旋糖苷與核酸帶負電的磷酸骨架相互作用形成的復合物被細胞內(nèi)吞

瞬轉(zhuǎn)

相對簡便、結果可重復,,但對細胞有一定的毒副作用,,轉(zhuǎn)染時需除血清

生物轉(zhuǎn)入法

病毒介導法

通過侵染宿主細胞將外源基因整合到染色體中

穩(wěn)轉(zhuǎn)

可用于難轉(zhuǎn)染的細胞、原代細胞,,體內(nèi)細胞等

逆轉(zhuǎn)錄病毒

 

特定宿主

但攜帶基因不能太大細胞需處分裂期,,需考慮安全因素

腺病毒

通過侵染宿主細胞將外源基因整合到染色體中

瞬時轉(zhuǎn)染
特定宿主

可用于難轉(zhuǎn)染的細胞
需考慮安全因素

物理轉(zhuǎn)染法
 

Biolistic顆粒傳遞法

將DNA用顯微重金屬顆粒沉淀,再將包被好的顆粒用彈道裝置投射入細胞,,DNA在胞內(nèi)逐步釋放表達

瞬轉(zhuǎn)

可用于:人的表皮細胞,,纖維原細胞,淋巴細胞系以及原代細胞

電穿孔法

高脈沖電壓破壞細胞膜電位,,DNA通過膜上形成的小孔導入

穩(wěn)轉(zhuǎn),,瞬轉(zhuǎn)
所有細胞

適用性廣但細胞致死率高,DNA和細胞用量大

顯微注射法

用顯微操作將DNA直接注入靶細胞核

穩(wěn)轉(zhuǎn),,瞬轉(zhuǎn)

轉(zhuǎn)染細胞數(shù)有限,,多用于工程改造或轉(zhuǎn)基因動物的胚胎細胞

二、  脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法
1,、材料
293T細胞,、MyoD表達質(zhì)粒和EGFP表達質(zhì)粒、DMEM培養(yǎng)基,、鏈霉素/青霉素(雙抗),、FCS(小牛血清)、PBS(磷酸鹽緩沖溶液),、胰酶/EDTA消化液,、轉(zhuǎn)染試劑(TransFast)
2、器材
20ul/200ul/1ml微量移液器和Tip頭酒精燈,、廢液缸,、血球計數(shù)板、渦旋振蕩器,、恒溫水浴箱,、臺式離心機、35mm培養(yǎng)皿,、轉(zhuǎn)染管,、15ml離心管、觀察用倒置顯微鏡熒光顯微鏡和CCD
3,、實驗步驟
細胞傳代
(1)試驗準備:200ul/1mlTip頭各一盒(以上物品均需高壓滅菌),,酒精棉球,廢液缸,,試管架,,微量移液器,記號筆,培養(yǎng)皿,,離心管,。

......

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