您好, 歡迎來(lái)到化工儀器網(wǎng)
采用冷凍干燥工藝制備地區(qū)性凝血因子
上海市臨床檢驗(yàn)中心于2014 年分別開(kāi)展了凝血
因子的室間質(zhì)評(píng)計(jì)劃［2］,。但所采用的室間調(diào)查
品均為進(jìn)口商品質(zhì)控品，由于價(jià)格昂貴,、濃度水平
單一，無(wú)法滿(mǎn)足室間質(zhì)評(píng)的需要,。我們采用冷凍
干燥技術(shù)處理新鮮血漿,，制備凝血因子室間調(diào)查
品，并在上海地區(qū)開(kāi)展凝血因子室間調(diào)查活動(dòng),。
材料和方法
一,、材料和儀器
所用試劑和儀器分別見(jiàn)表1 和表2。
表1 試劑使用表
試劑級(jí)別廠家或供應(yīng)商
海藻糖分析純SIGMA 公司
乳糖分析純SIGMA 公司
聚乙二醇( PEG) 分析純SIGMA 公司
( HEPES)
分析純SIGMA 公司
甘氨酸分析純SIGMA 公司
凝血酶原時(shí)間( PT) 試劑商品試劑SIMENES 公司
活化部分凝血活酶時(shí)間
( APTT) 試劑
商品試劑SIMENES 公司
纖維蛋白原試劑商品試劑SIMENES 公司
乏因子血漿Ⅷ 商品試劑SIMENES 公司
氯化鈣( CaCL2
) 商品試劑SIMENES 公司
新鮮冰凍血漿采血時(shí)間為2013 年
1 月～ 10 月,，有效期
1 年
上海市血液中心
長(zhǎng)海醫(yī)院輸血科
表2 儀器使用表
名稱(chēng)型號(hào)廠家
電子天平BSA2245-CW,，精度
d = 0． 1 mg
Sartorius 公司
三洋超低溫冰箱SANYO Biomedcial
Freezer
真空冷凍干燥機(jī)Christ 1-4 LSC plus 德國(guó)Christ 公司
水平式離心機(jī)Allegra@ X-15Ｒ
Centrifuge
Beckman-Coulter 公司
水浴箱TW20 Julabo
全自動(dòng)血凝儀CA-1500 Sysmex 公司
全自動(dòng)血凝儀Evolution STAGO 公司
全自動(dòng)血凝儀TOP IL 公司
全自動(dòng)分裝儀Dose-it 803
IBS INTEGＲA
BIOSCIENCES
無(wú)菌超濾器7518-00 Masterflex 公司
二、方法
1． 血漿選擇和處理獻(xiàn)漿員經(jīng)測(cè)試乙肝表面
抗原,、丙肝抗體和人類(lèi)免疫缺陷病毒-1 ( HIV-1)
抗體檢測(cè)均陰性,。制備的室間調(diào)查品凝血因子Ⅷ
包括低、中和高3 個(gè)濃度水平,。凝血因子血漿的
制備方法: 抗凝劑為枸櫞酸鹽,、磷酸鹽、葡萄糖和腺
嘌呤( CPD-A ) ,，抗凝劑與血漿比例為
36 mL ∶ 200 mL,，血液以1 200 × g 離心15 min，分
離上層液體至三聯(lián)袋中得到血漿,，在22 ℃條件下
以2 300 × g 離心10 min( 每單位血漿加入凍干保
護(hù)劑,，然后以相同條件離心后待用，經(jīng)檢測(cè)凝血因
子濃度約為40% ～ 100%,，可作為高濃度凝血因
子血漿［3］,。( 1) 低濃度凝血因子血漿的制備方
法: 血漿中加入硫酸鋇( BaSO4
) 與血漿比率為
1 ∶ 7( w /v) ( BaSO4
需經(jīng)121 ℃高壓滅菌15 min) ，
加入后在混勻器上混勻30 min,。以2 300 × g 離
心10 min,。取上清液，即為凝血因子含量低濃度
的血漿; ( 2) 中濃度凝血因子血漿的制備方法: 將
低濃度凝血因子血漿與未處理的原液按一定比例
稀釋?zhuān)傻玫侥蜃英鴿舛葹?% ～ 50% 的各
濃度血漿,。配制后的血漿濃度與預(yù)期濃度比較,，
用回歸方程統(tǒng)計(jì)，并用配對(duì)t 檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)配制結(jié)果
是否符合預(yù)期) ,。
2． 凍干保護(hù)劑配方為提高凍干制品的穩(wěn)
定性,，在凍干前需在血漿中加入一定配方的凍
干保護(hù)劑。( 1) 初篩實(shí)驗(yàn): 實(shí)驗(yàn)采用HEPES、甘
氨酸,、PEG,、海藻糖按不同的配比分成10 個(gè)組
別，添加入血漿后在相同的真空壓力下進(jìn)行冷
凍干燥［4］,，測(cè)定PT 和APTT 結(jié)果,，通過(guò)APTT、
PT,、Fbg 變化情況,、凍干品外觀兩個(gè)方面選擇凍
干前、后樣本測(cè)定值變化zui小,，且凍干品外觀zui
佳的保護(hù)劑［5］; ( 2) 凍干保護(hù)劑配方的優(yōu)化: 采
用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方式［6］,，該設(shè)計(jì)是研究多因
素多水平的一種設(shè)計(jì)方法，根據(jù)正交性從全面
試驗(yàn)中挑選出部分有代表性的9 點(diǎn)進(jìn)行試驗(yàn),，
通過(guò)這9 個(gè)點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果，并按一定的統(tǒng)計(jì)分
析方法,，以獲取*配比組合,。
計(jì)算極差Ｒ 值，Ｒ 值為平均試驗(yàn)結(jié)果與
zui差平均試驗(yàn)結(jié)果的差值,，反映此因素對(duì)于考察
指標(biāo)的影響程度,。差值z(mì)ui大的因素為zui主要的因
素，依次類(lèi)推,，從而得到*的海藻糖,、甘氨酸和
HEPES 組合。
3． 血漿分裝由于凍干品是采用冷凍干燥技
術(shù)將原有液態(tài)樣本進(jìn)行冷凍干燥處理使其成為固
態(tài),，使用時(shí)將凍干品中加入定量的液體,，復(fù)溶成液
態(tài)樣品。因此,，對(duì)分裝的樣本量有精度要求,。本
實(shí)驗(yàn)采用IBS 公司的Dose-it 803 分裝儀對(duì)血漿進(jìn)
行分裝，并在分裝的過(guò)程中抽取一定比例的樣本
( 每5 支抽取1 支) ,，共抽取10 支,，用稱(chēng)重法得
到分裝前、后樣本的重量,，兩者重量相減即為
分裝的樣本量,，計(jì)算后得到分裝精度。評(píng)價(jià)方
·270· 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)2015 年3 月第30 卷第3 期Laboratory Medicine,，March 2015,，Vol 30． No 3．
法采用樣本加入量的平均值( s) 和變異系數(shù)
( CV% ) 。分裝精度與歐洲凝血因子Ⅷ標(biāo)準(zhǔn)品
分裝精度相比較［3］。
4． 樣本凍干過(guò)程將在－ 40 ℃低溫冰箱中
預(yù)凍過(guò)夜的樣本,，快速放入Christ 凍干機(jī)按既定
程序完成冷凍干燥過(guò)程,，具體步驟包括: 啟動(dòng)凍干
機(jī)，預(yù)冷至－ 60 ℃放入制品,，在此溫度下進(jìn)行升
華干燥,，持續(xù)時(shí)間約為6 h; 提升隔板溫度進(jìn)行解
析干燥，持續(xù)時(shí)間為20 h,。凍干完成后加蓋放入
4 ℃保存,。
5． 凝血因子凍干品性能評(píng)估對(duì)制備的室間
調(diào)查品的性能進(jìn)行評(píng)估，其中均勻性和穩(wěn)定性應(yīng)
符合《能力驗(yàn)證樣品均勻性和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)指南》
( CNAS-GL03) 要求［7］,。此外,，凍干品的含水量應(yīng)
符合《中國(guó)藥典》的要求［8］。
6． 組織初步調(diào)查將制備的凍干血漿調(diào)查品
發(fā)放至上海5 家臨床實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行凝血因子活性的
實(shí)驗(yàn)室間評(píng)價(jià),。
結(jié)果
一,、不同濃度凝血因子Ⅷ的配制效果
采用回歸分析方法，將各濃度梯度調(diào)查品的
測(cè)定值與預(yù)期值進(jìn)行比較,，繪制預(yù)期值與實(shí)測(cè)值
的關(guān)系圖( 圖1) ,，計(jì)算回歸方程及r2 值分別為Y
= 0． 977 5X + 0． 747 8，r 2值為0． 995 2,。凝血因子
Ⅷ%實(shí)測(cè)值與預(yù)期值作配對(duì)t 檢驗(yàn),，結(jié)果差異無(wú)
統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P 值為0． 330，P ＞ 0． 05) ,。
注: Y = 0． 977 5X + 0． 747 8,，r2 = 0． 995 2
圖1 凝血因子Ⅷ的稀釋梯度
二、凍干保護(hù)劑篩選試驗(yàn)
初篩試驗(yàn)和配方優(yōu)化試驗(yàn),，結(jié)果見(jiàn)表3 ～ 6,。
表3 凍干保護(hù)劑初篩表
組別初始A B C D E F G H I J
PT( s) 11． 0 14． 6 14． 6 13． 6 12． 5 12． 3 / / 17． 0 16． 5 16． 8
APTT( s) 27． 1 40． 9 41． 3 34． 2 29． 9 33． 8 / / 52． 6 49． 7 51． 7
Fbg( g /L) 2． 348 2． 538 2． 493 2． 381 2． 285 2． 381 / / 2． 348 2． 239 2． 415
蓬松度輕度萎縮輕度萎縮輕度萎縮較好較好結(jié)塊結(jié)塊很好很好輕度萎縮
凍干前、后13． 8 14． 2 7． 1 2． 8 6． 7 / / 25． 5 22． 6 24． 6
APTT 差值
表4 配方優(yōu)化試驗(yàn)采用三水平,、三因素的正交表L9( 33 ) 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表( %)
濃度海藻糖( 因素1) 甘氨酸( 因素2) HEPES( 因素3)
濃度水平1 0． 5① 0． 10① 0． 10①
濃度水平2 1． 0② 0． 25② 0． 15②
濃度水平3 1． 5③ 0． 50③ 0． 20③
表5 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及測(cè)定實(shí)際測(cè)定結(jié)果( %)
樣本號(hào)序列
因素1
實(shí)際濃度
序列
因素2
實(shí)際濃度
序列
因素3
實(shí)際濃度( %)
凍干前FⅧ
實(shí)測(cè)值
凍干后FⅧ
實(shí)測(cè)值
1 ① 0． 5 ① 0． 10 ① 0． 10 76． 0 78． 0
2 ① 0． 5 ② 0． 25 ② 0． 15 72． 2 75． 0
3 ① 0． 5 ③ 0． 50 ③ 0． 20 70． 5 75． 7
4 ② 1． 0 ① 0． 10 ② 0． 15 69． 5 71． 0
5 ② 1． 0 ② 0． 25 ③ 0． 20 68． 9 69． 8
6 ② 1． 0 ③ 0． 50 ① 0． 10 69． 5 71． 0
7 ③ 1． 5 ① 0． 10 ③ 0． 20 68． 1 70． 7
8 ③ 1． 5 ② 0． 25 ① 0． 10 67． 8 72． 5
9 ③ 1． 5 ③ 0． 50 ② 0． 15 67． 8 70． 4
檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)2015 年3 月第30 卷第3 期Laboratory Medicine,，March 2015，Vol 30． No 3． ·271·
表6 正交試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)
樣本號(hào)因素1 因素2 因素3 回收率%
1 1 1 1 102． 6
2 1 2 2 104． 0
3 1 3 3 107． 3
4 2 1 2 102． 2
5 2 2 3 101． 3
6 2 3 1 102． 2
7 3 1 3 103． 9
7 3 1 3 103． 9
8 3 2 1 106． 9
9 3 3 2 103． 8
K1 313． 9 308． 8 311． 7
K2 305． 8 312． 1 312． 1
K3 314． 6 313． 4 312． 5
k1 104． 6 102． 9 103． 9
k2 101． 9 104． 0 104． 0
k3 104． 9 104． 5 104． 2
Ｒ 值2． 94 1． 54 0． 26
其中,，A 組為2． 5 mg /mL 氨基酸; B 組為
5 mg /mL 甘氨酸; C 組為10 mg /mL 甘氨酸; D 組
為5 mg /mL HEPES; E 組為10 mg /mL HEPES;
F 組為2． 5 mg /mL PEG; G 組為2． 5 mg /mL PEG;
H 組為2． 5 mg /mL 海藻糖; I 組為2． 5 mg /mL 海
藻糖; J 組為未加保護(hù)劑,。
按原定方案選擇凍干前、后差異較小,，凍干外
觀較佳的為B,、D、E,、H 組成分作為凍干保護(hù)劑的
主要成分,。
K1 為每列中所有“1”序列之和,，K2 為每列中
所有“2”序列之和，K3 為每列中所有“3”序列之
和; k1 = K1 /3,，k2 = K2 /3,，k3 = K3 /3; Ｒ 值為極差
值，為每列中zui大值與zui小值的插值,，Ｒ 值z(mì)ui大為
因素1,，Ｒ 值z(mì)ui小為因素3，因素1 ＞ 因素2 ＞ 因素
3,。據(jù)此得出,，海藻糖為主要因素，對(duì)每個(gè)因素的
k3 zui大,，所以*配方是海藻糖( 1． 5%) ,、甘氨酸
( 0． 5%) 和HEPES( 0． 2%) 。血漿中加入此配方
的保護(hù)劑,，凍干后凝血Ⅷ% 的回收率能達(dá)到
100%左右,。
三、分裝精度的評(píng)價(jià)
結(jié)果見(jiàn)表7,。統(tǒng)計(jì)得到分裝精度為每瓶的平
均分裝值為0． 569 9 g( 扣除試管本身重量) ,，范圍
為0． 564 6 ～ 0． 576 7 g，s 為0． 003 5 g,，CV 為
0． 61%，與歐洲凝血因子Ⅷ標(biāo)準(zhǔn)品分裝精度CV
為0． 61%相一致,。
四,、調(diào)查品評(píng)估
1． 均勻性和穩(wěn)定性用同質(zhì)性檢驗(yàn)證明樣本
一致性程度，由于凝血因子Ⅷ%一期法檢測(cè)是基于
APTT 實(shí)驗(yàn)的,，所獲得的凝血因子Ⅷ%測(cè)定值為通
過(guò)定標(biāo)曲線折算后的結(jié)果,，所以同質(zhì)性檢驗(yàn)以
APTT 秒數(shù)為基準(zhǔn)。以?xún)龈汕?、后APTT 測(cè)定值( 秒
數(shù)) 的平均數(shù)計(jì)算均勻性和穩(wěn)定性結(jié)果,，見(jiàn)表8。
表7 凍干樣本的分裝精度
數(shù)值
空瓶重量
( g)
加樣0． 5 mL 血漿后
瓶重( g)
加入血漿量
( g)
凍干后瓶重
( g)
凍干品重量
( g)
凍干前,、后差值
平均值5． 963 8 6． 533 7 0． 569 9 6． 007 2 0． 043 4 0． 526 5
標(biāo)準(zhǔn)差0． 020 0 0． 021 9 0． 003 5 0． 021 5 0． 002 5 0． 002 0
CV% 0． 334 6 0． 334 6 0． 613 2 0． 357 1 5． 670 4
表8 均勻性和穩(wěn)定性結(jié)果
評(píng)價(jià)項(xiàng)目
APTT( s)
均勻性
單因素ANOVA
穩(wěn)定性
T 檢驗(yàn)|珋x － 珋y |≤0． 3σ
0． 06 P = 0． 053 0． 07
界值F 界值= 3． 02 α = 0． 05 水平1． 702
結(jié)論F = 0． 06 ＜ 3． 02 均勻性符合要求P = 0． 053 ＞ 0． 05 兩組均值差異
無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義
|珋x － 珋y | = 0． 07 ＜ 1． 702 穩(wěn)定性符
合要求
2． 樣本含水量應(yīng)用Karl Fischer 滴定分析
法測(cè)定凍干樣本的含水量,。按《中國(guó)藥典》規(guī)定，
凝血因子Ⅷ凍干品的含水量應(yīng)小于3%,，我們自
制凍干品平均含水量為1． 22%,，s 為0． 197%，CV
為16%,，符合要求,。
五,、實(shí)驗(yàn)室室間調(diào)查
采用自制質(zhì)控品水平1、水平2,、水平3,，結(jié)果
見(jiàn)表9。
·272· 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)2015 年3 月第30 卷第3 期Laboratory Medicine,，March 2015,，Vol 30． No 3．
表9 各醫(yī)院凝血因子Ⅷ%的檢測(cè)結(jié)果
醫(yī)院儀器品牌水平1 水平2 水平3
ＲJ1 ACL-TOP 7． 1 43． 3 73． 0
ＲJ2 CA-7000 6． 4 50． 3 78． 5
HS CA-7000 7． 7 52． 5 100． 0
PT CA-1500 10． 6 66． 7 130． 0
SCCL CA-1500 7． 0 49． 2 78． 1
均值7． 8 52． 4 91． 9
s 1． 7 8． 7 23． 7
CV( %) 21． 3 16． 6 25． 8
討論
上海地區(qū)目前多家三級(jí)醫(yī)院開(kāi)展凝血因子檢
測(cè)項(xiàng)目。上海市臨床檢驗(yàn)中心對(duì)凝血項(xiàng)目的開(kāi)展
情況進(jìn)行了一次調(diào)查,，發(fā)現(xiàn)凝血項(xiàng)目檢測(cè)( 包括
凝血因子) 普遍存在的問(wèn)題: ( 1) 試劑批號(hào)更換頻
繁: 檢測(cè)人員無(wú)法獨(dú)立完成定標(biāo)操作,，主要依靠廠
商的技術(shù)員。每次檢測(cè)前未進(jìn)行定標(biāo)操作; ( 2)
定標(biāo)方法錯(cuò)誤: 未采用實(shí)測(cè)法獲得定標(biāo)曲線; ( 3)
實(shí)驗(yàn)室未參加室間質(zhì)評(píng)計(jì)劃,，無(wú)法評(píng)價(jià)不同實(shí)驗(yàn)
室檢測(cè)結(jié)果之間的一致性,。為此，開(kāi)展凝血因子
室間調(diào)查非常有必要,。
通過(guò)我們的研究表明,，凝血因子的均勻性和
穩(wěn)定性符合《能力驗(yàn)證樣品均勻性和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)
指南》的要求，室間調(diào)查結(jié)果顯示,，自制凝血因子
凍干品和商品化的質(zhì)控品在所調(diào)查的5 家醫(yī)院實(shí)
驗(yàn)室結(jié)果間CV% 分別為: 水平1( 21． 3%) ,，水平
2( 16． 6%) ，水平3( 25． 8%) ,，與衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)
中心的調(diào)查結(jié)果( CV 約20%) 比較接近,，所以自
制凝血因子調(diào)查品的測(cè)定結(jié)果也部分反映實(shí)驗(yàn)室
的實(shí)際檢測(cè)水平。
凝血因子檢測(cè)項(xiàng)目的逐步開(kāi)展,，凝血因子檢
測(cè)的規(guī)范化也隨之完善,，世界血友病聯(lián)盟( WFH)
也對(duì)凝血因子的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)提出規(guī)范化要求。在
上海,，開(kāi)展凝血因子檢測(cè)項(xiàng)目的實(shí)驗(yàn)室遠(yuǎn)低于國(guó)
外的實(shí)驗(yàn)室,，凝血因子的檢測(cè)方法絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)
室仍然局限于一期法。使用高敏試劑的實(shí)驗(yàn)室數(shù)
量極少,。每批凝血因子項(xiàng)目檢測(cè)進(jìn)行重新定標(biāo)的
實(shí)驗(yàn)室也很少,。這種情況與國(guó)外實(shí)驗(yàn)室的因子檢
測(cè)水平相比存在較大差距。2002 年已經(jīng)頒布
WS /T 220-2002《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)
凝血因子活性測(cè)定總則》,。
此次制備的凝血因子調(diào)查品缺乏溯源性,，調(diào)
查沒(méi)有采用經(jīng)賦值的凍干品。對(duì)于某個(gè)室間調(diào)查
項(xiàng)目,，參加實(shí)驗(yàn)室少于10 家的情況下,，由于所采
用的檢測(cè)系統(tǒng)不同，無(wú)法將所有實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)結(jié)
果相加求平均值,，造成所有檢測(cè)結(jié)果未達(dá)到統(tǒng)計(jì)
學(xué)zui少例數(shù),，降低了統(tǒng)計(jì)結(jié)果的可靠性,。這種情
況下可由兩種解決方法: ( 1) 采用經(jīng)賦值的凍干
調(diào)查品進(jìn)行室間調(diào)查，即將已賦值的調(diào)查品發(fā)放
至各實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行室間調(diào)查,，將回饋結(jié)果與賦值結(jié)
果相比較,，得到反饋報(bào)告; ( 2) 增加調(diào)查實(shí)驗(yàn)室的
個(gè)數(shù)，達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)要求,。
不同國(guó)家和地區(qū)相繼建立自身的凝血因子檢
測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)品體系,。中檢院雖然凝血因子Ⅷ標(biāo)準(zhǔn)品
出售，但價(jià)格昂貴,，缺乏臨床使用價(jià)值,。臨床上使
用zui多的還是商品化的標(biāo)準(zhǔn)血漿，由于每個(gè)系統(tǒng)
所用標(biāo)準(zhǔn)血漿不同,，檢測(cè)結(jié)果的可比性存在一定
差異,。文獻(xiàn)表明凝血因子檢測(cè)的zui主要的影響因
素是標(biāo)準(zhǔn)品存在差異。此外,，上海市臨床檢驗(yàn)中
心的主要職能就是幫助各醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室操作者掌握
標(biāo)準(zhǔn)的操作規(guī)范,，為此我們實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該為需要的
實(shí)驗(yàn)室提供。并且作為世界衛(wèi)生組織
( WHO) 試劑合作中心,，我們應(yīng)加強(qiáng)與WHO 在
Shefield 的凝血總部合作,，研制出一種可以溯源至
國(guó)內(nèi)甚至標(biāo)準(zhǔn)品的比對(duì)物質(zhì)，然后將凍干品
發(fā)放給各醫(yī)院的實(shí)驗(yàn)室,，與臨床樣本同步檢測(cè),，這
樣可以提高檢測(cè)的可靠性。同時(shí)也為臨床實(shí)驗(yàn)室
節(jié)約成本支出,。
參考文