目錄:合肥恩派爾貿易有限公司>>Abnbio感受態(tài)細胞>>酵母 感受態(tài)細胞>> EGY48Chemically 酵母感受態(tài)細胞
| 供貨周期 | 現貨 | 規(guī)格 | 50支100ul |
|---|---|---|---|
| 貨號 | ABG704-50 | 應用領域 | 化工,生物產業(yè),制藥/生物制藥 |
| 主要用途 | 細胞培養(yǎng) |
EGY48 Chemically Competent Cell 酵母感受態(tài)細胞
基因型：
MATα, ura3, his3, trp1, LexAop (x6)-LEU2
簡要說明：
EGY48菌株是LexA系統酵母雙雜實驗用菌株,，MATα型,，可直接轉化質粒驗證蛋白互作或篩庫；Transformation marker為：his3,，trp1,ura3,，報告基因為：LEU2；報告基因UAS (上游激活序列)來源于LexA op(x6),，只有當Bait和Prey互作時才能啟動LEU2表達,。EGY48-LexA系統有三種配套質粒：pLexA、pB42AD,、p8op-LacZ,。質粒pLexA篩選標志為HIS3，用于表達DNA-BD與目標蛋白(Bait)的融合蛋白,；質粒pB42AD篩選標志為TRP1,，用于表達AD與目標蛋白(Prey)的融合蛋白,；報告質粒p8op-LacZ篩選標志為URA3，報告基因為LacZ,，報告基因UAS來源于LexAop(x6),，只有當Bait和Prey互作時才能啟動LacZ表達。EGY48感受態(tài)細胞經特殊工藝制作,，pGBKT7質粒檢測轉化效率>104 cfu/μg DNA
操作說明：
1. 取pBait-AbAi質粒5µg,，BstBI或 BbsI酶切1h，回收,；
2. 取一支無菌的1.5ml EP管,，依次加入預冷的預冷的線性pBait-AbAi質粒1-5 µg（體積不高于15 µl），Carrier DNA(95-100 度5min 快速冰浴,，重復一次)10µl,，100µl冰上融化的Y1HGold感受態(tài)細胞，PEG/LiAc 500µl,，輕輕翻轉混勻6-8次,；
3. 30℃水浴30min，每10min輕輕翻轉混勻6-8次,；
4. 每支加入20µl的二甲基亞砜（用以提高轉化效率,，可不做）；
5. 42℃水浴15min,，每5min輕輕翻轉混勻6-8次,；
6. 12000rpm瞬時離心棄上清，每支加入1ml的YPD Plus（YPDA）于30℃復蘇1h（用以提高轉化效率,，可不做）,；
7. 12000rpm瞬時離心棄上清，用100µl 0.9% NaCl重懸,，涂板,，30℃培養(yǎng)48-96h。
注意事項：
1.PEG在低溫下易析出,，請在常溫下wan全溶解后使用,。
2.轉化高濃度的質粒可相應減少最終用于涂板的菌量,。
3.同時轉化2-3種質粒時可增加質粒的用量,。
4.Y1HGold酵母菌株對高溫敏感，最適生長溫度為27-30℃,；高于31℃,，生長速度和轉化效率呈指數下降。
5.菌落變粉不是污染,，是酵母細胞生長中一個常見現象,。當細胞在平板培養(yǎng)幾天后,，平板上的Adenine被酵母消耗完畢，酵母試圖通過自身代謝途徑合成Adenine以供利用,，然而,，Y1HGold的ADE2基因被破壞，Adenine合成途徑受阻,；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中間產物P-ribosylaminoimidazole（AIR）在細胞中積累而使菌落變?yōu)榉奂t色,。
6.酵母在缺陷培養(yǎng)基中生長速度比YPDA培養(yǎng)基慢,，培養(yǎng)基中缺陷成分越多，生長越慢,，以轉化涂板為例：涂YPDA平板29℃,，48h培養(yǎng)可見直徑1mm克隆,；涂SD單缺平板29℃,，48-60h培養(yǎng)可見直徑1mm克隆，涂SD雙缺平板29℃,，60-80h培養(yǎng)可見直徑1mm克隆,，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培養(yǎng)可見直徑1mm克隆,。
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