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Y1HGold Chemically Competent Cell  酵母感受態(tài)細(xì)胞

基因型：

MATα, ura3-52, his3-200, ade2-101, trp1-901, leu2-3,112, gal4Δ, gal80Δ, met–, MEL1

簡(jiǎn)要說(shuō)明：

Y1HGold菌株是GAL4-AbA酵母單雜系統(tǒng)用菌株,，MATα型,，可直接轉(zhuǎn)化質(zhì)粒進(jìn)行篩庫(kù)試驗(yàn)。Transformation marker為：ura3,，leu2,；報(bào)告基因?yàn)椋篈bAr。Y1HGold-GAL4-AbA 酵母單雜系統(tǒng)需要兩種質(zhì)粒配套使用：pAbAi 和PGADT7,。質(zhì)粒pAbAi的篩選標(biāo)志為URA,，用于表達(dá)pBait-AbAi construct (1~3個(gè)bait DNA序列重復(fù)串聯(lián)后克隆到pAbAi中)；質(zhì)粒pGADT7的篩選標(biāo)志為L(zhǎng)EU,，用于表達(dá)AD(GAL4 C端768~881位氨基酸)與目標(biāo)蛋白 (Prey)的融合蛋白,。此外AbAr與營(yíng)養(yǎng)缺陷報(bào)告基因相比具有更低背景的優(yōu)點(diǎn)，可降低酵母單雜假陽(yáng)性發(fā)生的概率,。Y1HGold感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作,，pGADT7質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率>104 cfu/μg DNA。

操作說(shuō)明：

1. 取pBait-AbAi質(zhì)粒5µg,，BstBI或 BbsI酶切1h,，回收； 

2. 取一支無(wú)菌的1.5ml EP管,，依次加入預(yù)冷的預(yù)冷的線性pBait-AbAi質(zhì)粒1-5 µg（體積不高于15 µl）,，Carrier DNA(95-100 度5min 快速冰浴,，重復(fù)一次)10µl,，100µl冰上融化的Y1HGold感受態(tài)細(xì)胞，PEG/LiAc 500µl,，輕輕翻轉(zhuǎn)混勻6-8次,； 

3. 30℃水浴30min，每10min輕輕翻轉(zhuǎn)混勻6-8次,； 

4. 每支加入20µl的二甲基亞砜（用以提高轉(zhuǎn)化效率,，可不做）,； 

5. 42℃水浴15min，每5min輕輕翻轉(zhuǎn)混勻6-8次,； 

6. 12000rpm瞬時(shí)離心棄上清,，每支加入1ml的YPD Plus（YPDA）于30℃復(fù)蘇1h（用以提高轉(zhuǎn)化效率，可不做）,； 

7. 12000rpm瞬時(shí)離心棄上清,，用100µl 0.9% NaCl重懸，涂板,，30℃培養(yǎng)48-96h,。

注意事項(xiàng)：

1.PEG在低溫下易析出，請(qǐng)?jiān)诔叵聎an全溶解后使用,。 

2.轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少最終用于涂板的菌量。

 3.同時(shí)轉(zhuǎn)化2-3種質(zhì)粒時(shí)可增加質(zhì)粒的用量,。 

4.Y1HGold酵母菌株對(duì)高溫敏感,，最適生長(zhǎng)溫度為27-30℃；高于31℃,，生長(zhǎng)速度和轉(zhuǎn)化效率呈指數(shù)下降,。 

5.菌落變粉不是污染，是酵母細(xì)胞生長(zhǎng)中一個(gè)常見現(xiàn)象,。當(dāng)細(xì)胞在平板培養(yǎng)幾天后,，平板上的Adenine被酵母消耗完畢，酵母試圖通過(guò)自身代謝途徑合成Adenine以供利用,，然而,，Y1HGold的ADE2基因被破壞，Adenine合成途徑受阻,；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常,，所以造成中間產(chǎn)物P-ribosylaminoimidazole（AIR）在細(xì)胞中積累而使菌落變?yōu)榉奂t色。 

6.酵母在缺陷培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度比YPDA培養(yǎng)基慢,，培養(yǎng)基中缺陷成分越多,，生長(zhǎng)越慢，以轉(zhuǎn)化涂板為例：涂YPDA平板29℃,，48h培養(yǎng)可見直徑1mm克?。煌縎D單缺平板29℃,，48-60h培養(yǎng)可見直徑1mm克隆,，涂SD雙缺平板29℃，60-80h培養(yǎng)可見直徑1mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃,，80-90h培養(yǎng)可見直徑1mm克隆,。