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AGL1 Chemically Competent Cell  根癌(熱激)感受態(tài)細胞

基因型：

C58 RecA (rif R/carbR) Ti pTiBo542DT-DNA (strepR)Succinamopine

簡要說明：

AGL1菌株為C58, RecA型背景，核基因中含有篩選標簽——li福平抗性基因rif和羧芐qing霉素抗性基因carb,，為了便于轉化操作,，此菌株攜帶一無自身轉運功能的琥珀堿型Ti質粒 pTiBo542DT-DNA，此質粒含有vir基因（vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件,， pTiBo542DT-DNA質粒自身的T-DNA轉移功能被破壞,，但可以幫助轉入的雙元載體T-DNA順利轉移）,。pTiBo542DT-DNA型Ti質粒含有篩選標簽：strep,，賦予AGL1菌株 lian霉素抗性,，適用于水稻、擬南芥,、楊樹等植物的轉基因操作,，經(jīng)pCAMBIA2301質粒檢測轉化效率可達5×103cfu/μg。

操作說明：

1.取-80℃保存的農桿菌感受態(tài)于冰上待其部分融化,，處于冰水混合狀態(tài)時插入冰中,。

2.每100μl感受態(tài)加1ug（體積不大于10ul）質粒DNA，用手bo打管底混勻,，依次于冰上靜置5分鐘,、液氮5分鐘、28℃水浴5分鐘,、冰浴5分鐘,。

3.加入700μl無抗生素的LB或YEB液體培養(yǎng)基，于28℃振蕩培養(yǎng)2~3小時,。

4.6000rpm離心一分鐘收菌,，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天（當平板只含有50ug/ml kan 時,，28℃培養(yǎng)48h即可；平板中同時加入50ug/ml kan,，20ug/ml rif 時,，需28℃培養(yǎng)60h；如果使用的平板含有50ug/ml rif 則需要28℃培養(yǎng)72-90h）,。

注意事項：

1.加入質粒時體積不應大于感受態(tài)體積的1/10 ,；質粒不純或存在乙醇等有機物污染，轉化效率急劇下降,；質粒增大一倍,，轉化效率下降一個數(shù)量級。

2.混入質粒時應輕柔操作,。

3.轉化高濃度的質?？上鄳獪p少最終用于涂板的菌量,。

4.LI福平濃度不應高于25ug/ul，過高的LI福平濃度不利于農桿菌生長,，會降低其生長速度和轉化效率,。本公司感受態(tài)計算轉化效率時所用平板只含有50ug/ml kan，若所用平板含有20ug/ml rif則轉化效率降低到1/2,。

5.培養(yǎng)基中加入LI福平的目的是防止雜菌生長,、篩選農桿菌；根據(jù)所用菌株抗性加入LIAN霉素或QING大霉素可防止Ti質粒丟失,，但LIAN霉素不利于農桿菌的轉基因操作,，所以一般培養(yǎng)農桿菌時不考慮LIAN霉素或QING大霉素，Ti質粒丟失的概率極低（可以忽略）,。