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EHA105 Chemically Competent Cell  根癌(熱激)感受態(tài)細胞

基因型：

C58 (rif R) Ti pEHA105 (pTiBo542DT-DNA) (strepR)Succinamopine

簡要說明：

EHA105菌株由EHA105菌株改造而來，為C58型背景，核基因中含有篩選標簽——li福平抗性基因rif,，為了便于轉化操作,，此菌株攜帶一無自身轉運功能的琥珀堿型Ti質(zhì)粒pEHA105(pTiBo542DT-DNA) ,，此質(zhì)粒含有vir基因（vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件,，pEHA105 (pTiBo542DT-DNA)質(zhì)粒自身的T-DNA轉移功能被破壞,，但可以幫助轉入的雙元載體T-DNA順利轉移）,。pEHA105 (pTiBo542DT-DNA)型Ti質(zhì)粒含有篩選標簽：strep,，賦予EHA105菌株lian霉素抗性，適用于水稻,、煙草等植物的轉基因操作,，經(jīng)pCAMBIA2301質(zhì)粒檢測轉化效率可達104cfu/μg。

操作說明：

1.取-80℃保存的農(nóng)桿菌感受態(tài)于冰上待其部分融化,，處于冰水混合狀態(tài)時插入冰中,。

2.每100μl感受態(tài)加1ug（體積不大于10ul）質(zhì)粒DNA，用手bo打管底混勻,，依次于冰上靜置5分鐘,、液氮5分鐘、28℃水浴5分鐘,、冰浴5分鐘,。

3.加入700μl無抗生素的LB或YEB液體培養(yǎng)基，于28℃振蕩培養(yǎng)2~3小時,。

4.6000rpm離心一分鐘收菌,，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天（當平板只含有50ug/ml kan 時,，28℃培養(yǎng)48h即可,；平板中同時加入50ug/ml kan，20ug/ml rif 時,，需28℃培養(yǎng)60h,；如果使用的平板含有50ug/ml rif 則需要28℃培養(yǎng)72-90h）,。

注意事項：

1.加入質(zhì)粒時體積不應大于感受態(tài)體積的1/10 ；質(zhì)粒不純或存在乙醇等有機物污染,，轉化效率急劇下降,；質(zhì)粒增大一倍，轉化效率下降一個數(shù)量級,。

2.混入質(zhì)粒時應輕柔操作,。

3.轉化高濃度的質(zhì)粒可相應減少最終用于涂板的菌量,。

4.LI福平濃度不應高于25ug/ul,，過高的LI福平濃度不利于農(nóng)桿菌生長，會降低其生長速度和轉化效率,。本公司感受態(tài)計算轉化效率時所用平板只含有50ug/ml kan,，若所用平板含有20ug/ml rif則轉化效率降低到1/2。

5.培養(yǎng)基中加入LI福平的目的是防止雜菌生長,、篩選農(nóng)桿菌,；根據(jù)所用菌株抗性加入LIAN霉素或QING大霉素可防止Ti質(zhì)粒丟失，但LIAN霉素不利于農(nóng)桿菌的轉基因操作,，所以一般培養(yǎng)農(nóng)桿菌時不考慮LIAN霉素或QING大霉素,，Ti質(zhì)粒丟失的概率極低（可以忽略）。