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 間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基

MSC BeautiStemTM XF Medium

一,、目的：利用間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)分離臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。二,、材料：新生兒臍帶

三,、主要儀器：醫(yī)用手術(shù)器械,，生物安全柜，CO₂ 培養(yǎng)箱,，6 孔培養(yǎng)板,，T25 培養(yǎng)瓶

四、試劑：

表 1 MSC BeautiStemTM XF Medium

表 2 建議選用試劑

五,，實驗前準(zhǔn)備：

5.1  *培養(yǎng)基的準(zhǔn)備

5.1.1 凍存的 MSC BeautiStem^TM XF Supplement 在室溫或 2-8℃解凍,，避免反復(fù)凍融。

5.1.2   配制：MSC  BeautiStem^TM   XF  Basal  Medium（培養(yǎng)基）：MSC  BeautiStem^TM   XF

Supplement（添加物）：青鏈雙抗=500ml：3ml：5ml,，4℃保存,，2 周內(nèi)使用。

注 1：雙抗非必須,，建議原代（P0）時使用,。

注 2：培養(yǎng)基含 L-Glutamine，貯藏時避免長期照光,。

5.2  包被培養(yǎng)皿

或跳過此步驟,，直接加 2%血小板裂解物（P0500LT），促進 MSC 細(xì)胞貼壁與生長,。

          5.2.1 使用 DPBS 溶液（貨號：NA023-500ML）,，將 MSC 貼壁試劑稀釋 100 倍（1:100）。

          5.2.2 參照表 3,，加入適量的 1XMSC 貼壁試劑涂層培養(yǎng)皿或板,。

表 3  涂層過程中貼壁試劑建議使用量

 注 1：涂層的培養(yǎng)皿需在無菌條件下 2℃-8℃儲存，需在一周內(nèi)使用,。（標(biāo)示紅色為原廠建議使用量,，經(jīng)過實驗測試后可減半使用）

注 2：包被期間， 注意包被液不可以干掉,！

注 3：若使用預(yù)包被培養(yǎng)瓶（Corning 的 CellBind,，貨號：3289/3290 等）, 步驟 5.2 的包被可略過。

           5.2.3  輕輕搖動培養(yǎng)皿,，確認(rèn)貼壁試劑均勻分布在培養(yǎng)皿表面后,，用封口膜包裹涂層的培養(yǎng)皿。

           5.2.4 在 2-8℃孵育過夜,；或者在 CO₂ 培養(yǎng)箱,，37℃，至少孵育 30 分鐘,。

           5.2.5 接種前, 吸除貼壁試劑,，再用 DPBS 輕輕沖洗培養(yǎng)皿，即可接種細(xì)胞。

5.3  制備 1X 大豆胰酶抑制劑

           5.3.1 使用無菌的 DPBS,，將 50X 大豆胰酶抑制劑（NA048-20ML）稀釋成 1X,。

六、使用范例：

6.1  UC-MSC 原代培養(yǎng) （組織塊法）

             6.1.1 無菌條件下取新鮮臍帶,，用 DPBS 漂洗凈血跡

*   一般臍帶取得非無菌環(huán)境,，可以稍微用 75%酒精潤洗,。

              6.1.2 置 10cm 培養(yǎng)皿中,，剪成 1~2cm 臍段，剔除血管,，用 DPBS 洗凈血跡,，再剪成 1mm3

組織塊。(圖 1)

               6.1.3 用無菌滴管吸取少量細(xì)小組織塊均勻散布在 6 孔板 2 個孔中,。

               6.1.4  37℃,，5%CO₂ 培養(yǎng)箱孵育 30min，以使組織塊粘貼在培養(yǎng)皿壁上,。

6.1.5  向每孔滴加 0.8ml *培養(yǎng)基 (注意沿孔壁小心滴加,，勿使沖動組織塊)。

 6.1.6  37℃,，5% CO₂ 培養(yǎng)箱孵育過夜,，次日 (D1) 每孔再補加 1ml *培養(yǎng)基。

                6.1.7 37℃,，5% CO₂ 繼續(xù)培養(yǎng),，5 天 (D6) 后半量換液 (此時一般看不到細(xì)胞，但快 3

天就可看到細(xì)胞從組織邊沿爬出),。

           6.1.8 再過 5 天后半量換液 (此時一般會有細(xì)胞爬出,，但晚可到 14 天會出現(xiàn)細(xì)胞從組織邊沿爬出) (圖 2、圖 3),。

 6.1.9 每 2 天換一次培養(yǎng)液,，繼續(xù)培養(yǎng) 2~4 天，待細(xì)胞融合度（Confluency）達(dá)到約 80%

后傳代培養(yǎng)(圖 4),。

注 1：組織塊培養(yǎng)的關(guān)鍵是要保障組織塊始終貼壁,，換液動作要盡可能輕微，避免沖動組織塊,。培養(yǎng)基加量不能太多,，以免組織塊漂浮。

注 2：為增加成功率,，從原代分離臍帶和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞, 培養(yǎng)基可加 2.5%的人 AB 血清(人 AB 型血清必須除菌過濾,，且 HbsAG 及 HCV/HIV 抗體陰性)。

6.2  UC-MSC 原代培養(yǎng) （消化法）

MSC BeautiStem^TM  XF Medium 也能有效地培養(yǎng)消化法取得的原代細(xì)胞，操做方式可依各實驗室的實驗步驟,，或參考上海中韜 MSC ACF Tissue Digestive Mix (貨號：C35010010) 的使用說明,。

6.2.1  將臍帶用 DPBS 漂洗干凈，剪成 1-2cm,后剔除血管,。

*   一般臍帶取得非無菌環(huán)境,，可以稍微用 75%酒精潤洗。

6.2.2 將組織剪成 3-5mm3 后,，移入 50ml 離心管,，再加入的分離液。

*   一條長度 10 公分的臍帶建議加入 10ml 的分離液,；或者組織塊 : 分離液（vol）= 1:1,。

** 視情況而定，可自行在分離液中添加 1%青鏈雙抗(BI, Cat# 03-031-1B) ,。

6.2.3 把 50ml 離心管橫放在 37 度細(xì)胞培養(yǎng)箱,，過夜反應(yīng)（16 小時）。

*   若總反應(yīng)體積較大,，也可持續(xù)旋轉(zhuǎn)混合,。

6.2.4 加入和分離液等體積的 0.05%EDTA（NANOLAB, Cat#NA015-100ML）終止反應(yīng)后，1500 xg 離心5 分鐘,，去除上清,。

*   溶液比較濃稠，小心不要影響下層的細(xì)胞;建議留下 5ml 左右的溶液,。

** 若是脂肪組織,，沒有粘稠的情形，以常規(guī)的 200-300 xg 離心即可,。

*** 沒有 EDTA, 可使用無鈣鎂 DPBS 取代,；此時建議后面步驟 6 多重復(fù) 2-3 次,，以確實去除酵素,。

6.2.5 以和分離液等體積的無鈣鎂 DPBS 重懸細(xì)胞后，500 xg 離心 5 分鐘,，去除上清,。

6.2.6 再次以和分離液等體積的無鈣鎂 DPBS 重懸細(xì)胞后,，250 xg 離心 5 分鐘，去除上清,。

6.2.7 用適量的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后,，即可按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法接種 P0 代細(xì)胞培養(yǎng)。

*   消化后的原代細(xì)胞,，建議培養(yǎng)時接種密度提高到 10,000/cm2 以上,；傳代后即可按常規(guī)的接種密度培養(yǎng),。

6.3  UC-MSC 傳代培養(yǎng)與凍存

        6.3.1   待細(xì)胞融和度達(dá)到約 80%后進行傳代（細(xì)胞不能太密集，否則容易分化）,，吸棄傳代板孔中的培養(yǎng)基,，每孔加適量 DPBS 輕輕沖洗 1 次。

         6.3.2  根據(jù)培養(yǎng)皿適量加入重組胰酶-EDTA（貨號：NA079-100ML,，T25 建議使用 1ml）,，在 37℃，5% CO₂ 培養(yǎng)箱作用 3~5 min（可輕拍培養(yǎng)瓶幫助細(xì)胞脫落）,。

6.3.3 顯微鏡下觀察細(xì)胞*脫落后, 根據(jù)重組胰酶-EDTA 使用量加入10 倍體積的大豆胰

酶抑制劑（1X）,，1000rpm 離心 3~5min。例：用 1ml 重組胰酶-EDTA,，則加入 1ml

大豆胰酶抑制劑（1X）與細(xì)胞混和均勻,，再離心,。

             6.3.4謹(jǐn)慎吸出上清,，細(xì)胞團塊用適當(dāng)體積的*培養(yǎng)基懸浮后，混勻細(xì)胞懸液,。

             6.3.5 按照所需的比例進行傳代或按照 5000-6000cells/cm2 的細(xì)胞密度將細(xì)胞接種至培養(yǎng)器皿中,，放入 37℃, 5% CO₂ 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

             6.3.6每 2-3 天更換一次培養(yǎng)基,， 待細(xì)胞融合度達(dá)到 80% 左右時,，參照操作步驟

6.3.1~6.3.5 做細(xì)胞傳代;或者參照操作步驟 6.3.1~6.3.3 收獲細(xì)胞凍存。

        6.3.7 細(xì)胞凍存：將細(xì)胞團塊懸浮于適量 (0.5~1×106cells/ml) MSC 凍存液（貨號： NA712-10ML）中,，裝入凍存管,，2~8℃冰箱放置 30min，-80℃冰箱放置 24h,，轉(zhuǎn)入液氮罐凍存,。

注：本方法僅供參考，用戶可根據(jù)自身經(jīng)驗做合理調(diào)整,。附圖：（如下是組織塊法,，建議客戶可以嘗試消化法）