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康寧 Corning         430659           可立外旋凍存管         2.0ml          50支/包,10包/箱

康寧 Corning       430658         可立外旋凍存管         1.2ml         50支/包,10包/箱

康寧 Corning       430488         可立外旋凍存管         2.0ml         50支/包,10包/箱

康寧 Corning         430663         可立外旋凍存管       5.0ml       50支/包,10包/箱

細(xì)胞凍存,、解凍方法與細(xì)胞計(jì)數(shù)
一,、細(xì)胞冷凍保存
1.材料：
生長(zhǎng)良好之培養(yǎng)細(xì)胞、新鮮培養(yǎng)基,、DMSO(Sigma D-2650),、無(wú)菌塑料冷凍保存管(Nalgene　5000-0020)、0.4％（w/v）trypan blue(GibcoBRL15250-061),、血球計(jì)數(shù)盤與蓋玻片,、等速降溫機(jī)(KRYO10SeriesII)
2、冷凍保存方法：
（1）傳統(tǒng)方法: 冷存管置于4℃10分鐘--->-20℃30分鐘--->-80℃16～18小時(shí)(或隔夜)--->液氮槽vaporphase*儲(chǔ)存,。
-20℃不可超過(guò)1小時(shí),，以防止胞內(nèi)冰晶過(guò)大，造成細(xì)胞大量凋落，亦可跳過(guò)此步驟直接放入-80℃冰箱中,，惟存活率稍微降低一些,。
（2）程序降溫：利用已設(shè)定程序的等速降溫機(jī)以-1～-3℃/分鐘之速度由室溫降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase*儲(chǔ)存,。適用于懸浮型細(xì)胞與hybridoma之保存。
3,、步驟：
（1）冷凍前24-48小時(shí)更換半量或全量培養(yǎng)基,，使細(xì)胞處于指數(shù)生*。
（2）配制冷凍保存溶液(使用前配制)：另取一離心管,，加入培養(yǎng)基,、血清，逐滴加入二甲基亞砜（DMSO）至20%濃度,，即制成雙倍的凍存液,，置于室溫下待用。
（3）離心收集培養(yǎng)之細(xì)胞,，用加血清的培養(yǎng)基重懸起細(xì)胞,，取少量細(xì)胞懸浮液(約0.1ml)計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存活率。
（4）取與細(xì)胞懸液等量的凍存液,，緩慢逐滴加入細(xì)胞懸液,，并晃動(dòng)試管，制成細(xì)胞凍存懸液（DMSOzui后濃度為5～10％）,，使細(xì)胞濃度為1～5×106cells/ml,，混合均勻，分裝于已標(biāo)示*之冷凍保存管中,，1～2ml/vial,，并取少量細(xì)胞懸浮液作污染檢測(cè)。嚴(yán)密封口后,，注明細(xì)胞名稱,、代數(shù)、日期,。然后進(jìn)行凍存,。
4、注意事項(xiàng)：
（1）欲冷凍保存之細(xì)胞應(yīng)在生長(zhǎng)良好(logphase)且存活率高之狀態(tài),，約為80～90％致密度,。冷凍前檢測(cè)細(xì)胞是否仍保有其*性質(zhì)，例如hybridoma應(yīng)在冷凍保存前一至二日測(cè)試是否有抗體之產(chǎn)生,。
（2）細(xì)胞在液氮中可*凍存無(wú)*,，而不會(huì)影響細(xì)胞活力；在-70度可保存數(shù)月。
（3）注意冷凍保護(hù)劑之品質(zhì),。DMSO應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí),，無(wú)菌且無(wú)色(以0.22micron　FGLP　flon過(guò)濾或是直接購(gòu)買無(wú)菌產(chǎn)品，如Sigma D-2650),，以5～10ml小體積分裝,，4℃避光保存，勿作多次解凍,。Glycerol亦應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí),，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開(kāi)啟后一年內(nèi)使用,，因*儲(chǔ)存后對(duì)細(xì)胞會(huì)有毒性,。本方法中先制備雙倍凍存液，可避免DMSO直接加入時(shí)釋放的熱量對(duì)細(xì)胞的損傷,。緩慢逐滴加入細(xì)胞懸液是使細(xì)胞逐步適應(yīng)高滲,，可降低細(xì)胞受損。DMSO可能引起部分白血病細(xì)胞株的分化,，可換用10%甘油凍存,。
（4）冷凍保存之細(xì)胞濃度：
①normal human fibroblast:1～3×106cells/ml
②hybridoma:1～3×106cells/ml，細(xì)胞濃度不要太高,，某些hybridoma會(huì)因冷凍濃度太高而在解凍24小時(shí)后消失,。
③adherent tumor lines:5～7×106，依細(xì)胞種類而異,。Adenocarcinoma解凍后須較高之濃度,，而HeLa只需1～3×106cells/ml
④other suspensions:5～10×106cells/ml，human lymphocyte須至少5×106cells/ml,。
（5）冷凍保護(hù)劑濃度為5或10％DMSO,，若是不確定細(xì)胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時(shí),，亦應(yīng)作一個(gè)backup culture,，以防止冷凍失敗。
（6）凍存可用10%～90%的血清,，一般高濃度血清有助于維護(hù)細(xì)胞活力,，此處介紹20%終濃度有利于細(xì)胞懸浮而少沉積（4度時(shí)），復(fù)蘇存活率在80%～90%以上,，對(duì)原代培養(yǎng)細(xì)胞,，以90%血清凍存更為有效。

二,、冷凍細(xì)胞活化
1,、冷凍細(xì)胞之活化原則為快速解凍，以避免冰晶重新結(jié)晶而對(duì)細(xì)胞造成傷害，導(dǎo)致細(xì)胞之si亡,。
2,、細(xì)胞活化后，約需數(shù)日,，或繼代一至二代,，其細(xì)胞生長(zhǎng)或特性表現(xiàn)才會(huì)恢復(fù)正常(例如產(chǎn)生單株抗體或是其它蛋白質(zhì))。
3,、材料
37℃恒溫水槽,、新鮮培養(yǎng)基、無(wú)菌吸管/離心管/培養(yǎng)瓶,、液氮或干冰容器
4、步驟：
（1）操作人員應(yīng)戴防護(hù)面罩及手套,，防止冷凍管可能爆裂之傷害,。
（2）自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊,，由于熱脹冷縮過(guò)程,，此時(shí)蓋子易松掉。
（3）將新鮮培養(yǎng)基置于37℃水槽中回溫,，回溫后噴以70%酒精并擦拭之,，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。
（4）取出冷凍管,，立即放入37℃水槽中快速解凍,，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化，以70%酒精擦拭保存管外部,，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi),。
（5）取出解凍之細(xì)胞懸浮液，緩緩加入有培養(yǎng)基之培養(yǎng)容器內(nèi)(稀釋比例為1:10～1:15),，混合均勻,，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取0.1ml解凍細(xì)胞懸浮液作存活測(cè)試,。
（6）解凍后是否立即去除冷凍保護(hù)劑(例如DMSO或glycerol),，依細(xì)胞種類而異，一般而言,，大都不需要立即去除冷凍保護(hù)劑,。惟若要立即去除，則將解凍之細(xì)胞懸浮液加入含有5-10ml培養(yǎng)基之離心管內(nèi),，離心1000rpm,，5分鐘，移去上清液，加入新鮮培養(yǎng)基,，混合均勻,，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
（7）若不需立即去除冷凍保存劑,，則在解凍培養(yǎng)后隔日更換培養(yǎng)基,。
三、細(xì)胞計(jì)數(shù)與存活測(cè)試
1,、原理：
（1）計(jì)算細(xì)胞數(shù)目可用血球計(jì)數(shù)盤或是Coultercounter粒子計(jì)數(shù)器自動(dòng)計(jì)數(shù),。
（2）血球計(jì)數(shù)盤一般有二個(gè)chambers，每個(gè)chamber中細(xì)刻9個(gè)1mm2大正方形,，其中4個(gè)角落之正方形再細(xì)刻16個(gè)小格,，深度均為0.1mm。當(dāng)chamber上方蓋上蓋玻片后,，每個(gè)大正方形之體積為1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml,。使用時(shí)，計(jì)數(shù)每個(gè)大正方形內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目,，乘以稀釋倍數(shù),，再乘以104，即為每ml中之細(xì)胞數(shù)目,。
（3）存活測(cè)試之步驟為dyeexclusion,，利用染料會(huì)滲入si細(xì)胞中而呈色，而活細(xì)胞因細(xì)胞膜完整,，染料無(wú)法滲入而不會(huì)呈色,。一般使用藍(lán)色之trypan blue染料，如果細(xì)胞不易吸收trypan blue,，則用紅色之Erythrosin bluish,。計(jì)算細(xì)胞活率：活細(xì)胞數(shù)/（活細(xì)胞數(shù)+si細(xì)胞數(shù)）×*。計(jì)數(shù)應(yīng)在臺(tái)盼蘭染色后數(shù)分鐘內(nèi)完成,，隨時(shí)間延長(zhǎng),，部分活細(xì)胞也開(kāi)始攝取染料；因?yàn)榕_(tái)盼蘭對(duì)蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的親和力,，用不含血清的稀釋液,，可以使染色計(jì)數(shù)更為準(zhǔn)確。
2,、材料：
0.4%w/v trypan blue(GibcoBRL15250-061),；Erythosin bluish stain；取0.1gram Erythrosin bluish(SigmaE-9259)及0.05gram preservative methyl paraben(SigmaH-3647)溶于100mlCa++/Mg++freesaline,；血球計(jì)數(shù)盤及蓋玻片(Hemocytometerandcoverslip),；計(jì)數(shù)器(counter),；低倍倒立顯微鏡；粒子計(jì)數(shù)器(Coultercounter,CoulterElectronics),。白細(xì)胞稀釋液（4%乙酸溶液）,。
3、步驟：
（1）取50μl細(xì)胞懸浮液與50μl trypan blue(orErythrosinbluish)等體積混合均勻于1.5ml小離心管中,。
（2）取少許混合液(約15μl)自血球計(jì)數(shù)盤chamber上方凹槽加入,，蓋上蓋玻片，于100倍倒立顯微鏡下觀察,，活細(xì)胞不染色,，si細(xì)胞則為藍(lán)色(或紅色-Erythrosin bluish)。
（3）計(jì)數(shù)四個(gè)大方格之細(xì)胞總數(shù),，再除4,，乘以稀釋倍數(shù)(至少乘以2，因與trypanblue等體積混合),，zui后乘以104,，即為每ml中細(xì)胞懸浮液之細(xì)胞數(shù)。若細(xì)胞位于線上,，只計(jì)上線與右線之細(xì)胞(或計(jì)下線與左線之細(xì)胞)。
注：4大格細(xì)胞總數(shù)×稀釋倍數(shù)×104/4=細(xì)胞數(shù)/ml,；每一大格的體積=0.1cm×0.1cm×0.01cm=10-4ml
計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)時(shí),，zui適濃度為5～10×105細(xì)胞/ml，此范圍外計(jì)數(shù)誤差偏大,。高濃度細(xì)胞懸液,，可取出部分作稀釋或連續(xù)稀釋后計(jì)數(shù)。
5,、范例：
T75 monolayer culture制成10ml細(xì)胞懸浮液,，取0.1ml溶液與0.1ml trypan blue混合均勻于試管中，取少許混合液加入血球計(jì)數(shù)盤,，計(jì)數(shù)四大方格內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目,。
活細(xì)胞數(shù)/方格：55，62,，49,，59；si細(xì)胞數(shù)/方格：5,，3,，4，6,；細(xì)胞總數(shù)=243
平均細(xì)胞數(shù)/方格=60.75,；稀釋倍數(shù)=2,；
細(xì)胞數(shù)/ml：60.75×104×2（稀釋倍數(shù)）=1.22×106；
細(xì)胞數(shù)/flask（10ml）：1.22×106×10ml=12.2×106
存活率：225/243﹦92.6%
細(xì)胞凍存,、解凍方法與細(xì)胞計(jì)數(shù)
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發(fā)布日期: 2006-08-14 11:28  文章來(lái)源: 丁香園 - 細(xì)胞技術(shù)討論版

關(guān)鍵詞: 細(xì)胞凍存  解凍  細(xì)胞計(jì)數(shù)

一,、細(xì)胞冷凍保存

1、材料：

生長(zhǎng)良好之培養(yǎng)細(xì)胞,、新鮮培養(yǎng)基,、DMSO（Sigma D-2650）、無(wú)菌塑料冷凍保存管（Nalgene　5000-0020）,、0.4％（w/v）trypan blue（GibcoBRL15250-061）,、血球計(jì)數(shù)盤與蓋玻片、等速降溫機(jī)（KRYO10SeriesII）,。

2,、冷凍保存方法：

（1）傳統(tǒng)方法：冷存管置于4℃10分鐘→ -20℃30分鐘→ -80℃16～18小時(shí)（或隔夜）→液氮槽vaporphase*儲(chǔ)存。-20℃不可超過(guò)1小時(shí),，以防止冰晶過(guò)大,，造成細(xì)胞大量si亡，亦可跳過(guò)此步驟直接放入-80℃冰箱中,，惟存活率稍微降低一些,。

（2）程序降溫：利用已設(shè)定程序的等速降溫機(jī)以-1～-3℃/分鐘之速度由室溫降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase*儲(chǔ)存,。適用于懸浮型細(xì)胞與hybridoma之保存,。

3、步驟：

（1）冷凍前一日前更換半量或全量培養(yǎng)基,，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情形,。

（2）配制冷凍保存溶液（使用前配制）：將DMSO加入新鮮培養(yǎng)基中，zui后濃度為5～10％,，混合均勻,，置于室溫下待用。

（3）依細(xì)胞繼代培養(yǎng)之操作,，收集培養(yǎng)之細(xì)胞,，取少量細(xì)胞懸浮液（約0.1ml）計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存活率。

（4）離心,，去除上清液,，加入適量冷凍保存溶液，使細(xì)胞濃度為1～5×106cells/ml,，混合均勻,，分裝于已標(biāo)示*之冷凍保存管中，1ml/vial,，并取少量細(xì)胞懸浮液作污染檢測(cè),。

4,、注意事項(xiàng)：

（1）欲冷凍保存之細(xì)胞應(yīng)在生長(zhǎng)良好（logphase）且存活率高之狀態(tài)，約為80–90％致密度,。

（2）冷凍前檢測(cè)細(xì)胞是否仍保有其*性質(zhì),，例如hybridoma應(yīng)在冷凍保存前一至二日測(cè)試是否有抗體之產(chǎn)生。

（3）注意冷凍保護(hù)劑之品質(zhì),。DMSO應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí),，無(wú)菌且無(wú)色（以0.22micron　FGLP　flon過(guò)濾或是直接購(gòu)買無(wú)菌產(chǎn)品，如Sigma D-2650）,，以5～10ml小體積分裝,，4℃避光保存，勿作多次解凍,。Glycerol亦應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí),，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開(kāi)啟后一年內(nèi)使用,，因*儲(chǔ)存后對(duì)細(xì)胞會(huì)有毒性,。

（4）冷凍保存之細(xì)胞濃度：
①normal human fibroblast:1～3×106cells/ml
②hybridoma：1～3×106cells/ml，細(xì)胞濃度不要太高,，某些hybridoma會(huì)因冷凍濃度太高而在解凍24小時(shí)后si去,。
③adherent tumor lines：5～7×106，依細(xì)胞種類而異,。Adenocarcinoma解凍后須較高之濃度,，而HeLa只需1～3×106cells/ml
④other suspensions：5～10×106cells/ml，human lymphocyte須至少5×106cells/ml,。

（5）冷凍保護(hù)劑濃度為5或10％DMSO，若是不確定細(xì)胞之冷凍條件,，在做冷凍保存之同時(shí),，亦應(yīng)作一個(gè)backup culture，以防止冷凍失敗,。

二,、冷凍細(xì)胞活化

1、冷凍細(xì)胞之活化原則為快速解凍,，以避免冰晶重新結(jié)晶而對(duì)細(xì)胞造成傷害,，導(dǎo)致細(xì)胞之si亡。

2,、細(xì)胞活化后,，約需數(shù)日，或繼代一至二代,，其細(xì)胞生長(zhǎng)或特性表現(xiàn)才會(huì)恢復(fù)正常（例如產(chǎn)生單株抗體或是其它蛋白質(zhì)）,。

3,、材料 ：37℃恒溫水槽、新鮮培養(yǎng)基,、無(wú)菌吸管/離心管/培養(yǎng)瓶,、液氮或干冰容器 。

4,、步驟：

（1）操作人員應(yīng)戴防護(hù)面罩及手套,，防止冷凍管可能爆裂之傷害。

（2）自液氮或干冰容器中取出冷凍管,，檢查蓋子是否旋緊,，由于熱脹冷縮過(guò)程，此時(shí)蓋子易松掉,。

（3）將新鮮培養(yǎng)基置于37℃水槽中回溫,，回溫后噴以70%酒精并擦拭之，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi),。

（4）取出冷凍管,，立即放入37℃水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化,，以70%酒精擦拭保存管外部,，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。

（5）取出解凍之細(xì)胞懸浮液,，緩緩加入有培養(yǎng)基之培養(yǎng)容器內(nèi)（稀釋比例為1：10～1：15）,，混合均勻，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),。取0.1ml解凍細(xì)胞懸浮液作存活測(cè)試,。

（6）解凍后是否立即去除冷凍保護(hù)劑（例如DMSO或glycerol），依細(xì)胞種類而異,，一般而言,，大都不需要立即去除冷凍保護(hù)劑。惟若要立即去除,，則將解凍之細(xì)胞懸浮液加入含有5-10ml培養(yǎng)基之離心管內(nèi),，離心1000rpm，5分鐘,，移去上清液,，加入新鮮培養(yǎng)基，混合均勻,，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),。

（7）若不需立即去除冷凍保存劑，則在解凍培養(yǎng)后隔日更換培養(yǎng)基,。

三,、細(xì)胞計(jì)數(shù)與存活測(cè)試

1,、原理：

（1）計(jì)算細(xì)胞數(shù)目可用血球計(jì)數(shù)盤或是Coultercounter粒子計(jì)數(shù)器自動(dòng)計(jì)數(shù)。

（2）血球計(jì)數(shù)盤一般有二個(gè)chambers,，每個(gè)chamber中細(xì)刻9個(gè)1mm2大正方形,，其中4個(gè)角落之正方形再細(xì)刻16個(gè)小格，深度均為0.1mm,。當(dāng)chamber上方蓋上蓋玻片后,，每個(gè)大正方形之體積為1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用時(shí),，計(jì)數(shù)每個(gè)大正方形內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目,，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以104,，即為每ml中之細(xì)胞數(shù)目,。

（3）存活測(cè)試之步驟為dyeexclusion，利用染料會(huì)滲入si細(xì)胞中而呈色,，而活細(xì)胞因細(xì)胞膜完整,，染料無(wú)法滲入而不會(huì)呈色。一般使用藍(lán)色之trypan blue染料,，如果細(xì)胞不易吸收trypan blue,，則用紅色之Erythrosin bluish。

2,、材料：

0.4%w/v trypan blue（GibcoBRL15250-061）,；Erythosin bluish stain；取0.1gram Erythrosin bluish（SigmaE-9259）及0.05gram preservative methyl paraben（SigmaH-3647）溶于100mlCa++/Mg++freesaline,；血球計(jì)數(shù)盤及蓋玻片（Hemocytometerandcoverslip）,；計(jì)數(shù)器（counter）；低倍倒立顯微鏡,；粒子計(jì)數(shù)器（Coultercounter,CoulterElectronics）,。

3、步驟：

（1）取50μl細(xì)胞懸浮液與50μl trypan blue（orErythrosinbluish）等體積混合均勻于1.5ml小離心管中,。

（2）取少許混合液(約15μl)自血球計(jì)數(shù)盤chamber上方凹槽加入，蓋上蓋玻片,，于100倍倒立顯微鏡下觀察,，活細(xì)胞不染色，無(wú)活性細(xì)胞則為藍(lán)色（或紅色-Erythrosin bluish）,。

（3）計(jì)數(shù)四個(gè)大方格之細(xì)胞總數(shù),，再除4，乘以稀釋倍數(shù)（至少乘以2,，因與trypanblue等體積混合）,，zui后乘以104,，即為每ml中細(xì)胞懸浮液之細(xì)胞數(shù)。若細(xì)胞位于線上,，只計(jì)上線與右線之細(xì)胞（或計(jì)下線與左線之細(xì)胞）,。

注：4大格細(xì)胞總數(shù)×稀釋倍數(shù)×104/4=細(xì)胞數(shù)/ml；每一大格的體積=0.1cm×0.1cm×0.01cm=10-4ml

4,、范例：

T75 monolayer culture制成10ml細(xì)胞懸浮液,，取0.1ml溶液與0.1ml trypan blue混合均勻于試管中，取少許混合液加入血球計(jì)數(shù)盤,，計(jì)數(shù)四大方格內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目,。

活細(xì)胞數(shù)/方格：55，62,，49,，59；無(wú)活性細(xì)胞數(shù)/方格：5,，3,，4，6,；細(xì)胞總數(shù)=243

平均細(xì)胞數(shù)/方格=60.75,；稀釋倍數(shù)=2

細(xì)胞數(shù)/ml：60.75×104×2（稀釋倍數(shù)）=1.22×106

細(xì)胞數(shù)/flask（10ml）：1.22×106×10ml=12.2×106

存活率：225/243﹦92.6%...