液相色譜儀的那些事基礎(chǔ)篇
液相色譜儀是屬于易學難用的儀器,，特別講究“正確使用”和經(jīng)驗。
液相工作者接觸最多的是流動相,，也就是流動相,，是造成液相色譜各種問題的最主要源頭。
液相色譜儀最常見的故障一是堵,，二是漏,。下面就這兩點分別展開討論。（注：流動相以甲醇為例,，色譜柱以C18為例）
先聊聊“堵”的情況
“堵”的表現(xiàn)現(xiàn)象就是柱壓異常升高,，直接原因就是流路不暢。堵塞的主要位置就是在色譜柱的前端,，最主要原因就是流動相里有雜質(zhì),，雜質(zhì)的主要來源就是細菌。
“堵”的原因之一：配制流動相時細菌污染
首先,，我們要認識到,，一般的國產(chǎn)甲醇其實不需要額外過濾處理，直接使用沒有問題,。即使是有些固態(tài)微粒雜質(zhì),，也能在液相流路系統(tǒng)最前端的過濾頭上排除，真正容易引起問題的,，是水中的細菌,。
新制備的純水在室內(nèi)放置幾天就會長菌，而這些細菌雖然肉眼不可見,，卻足以堵塞柱填料顆粒的空隙,，造成柱子很快報廢。這就是在配制流動相時造成的細菌污染的原因,，解決它的方法很簡單,，就是確保水的可靠性。這里有兩種方式推薦：
?。?）理想的方式當然是購買實驗室專用純水機,，既方便又可靠，質(zhì)量也放心。缺點就是價格不菲,。
?。?）成箱購買市售品牌純凈水，如,，500mL一支的怡寶或娃哈哈,，這些水的質(zhì)量足以應(yīng)付液相色譜的要求。先隨機抽取一支做一下細菌平板實驗,，待菌落數(shù)合格方可使用,。這樣每次只要單獨開一支即可，也很方便,。每次成本2元左右,。
※這里特別指出一個細節(jié)：在絕大多數(shù)書本上，凡談到配制流動相都會談到最后有一個過濾的步驟,。但是從我們長期使用的實際效果來說,，只要能保證水的質(zhì)量，這一步*可以也應(yīng)當去除,。
原因有以下三點：
?。?）流動相過濾在理論上有好處，但是,，實際操作時由于不可能做到專瓶專用,，反而容易造成的交叉污染，對于配比復雜的流動相影響更大,。
?。?）流動相過濾在經(jīng)濟成本上不劃算。買一套過濾裝置要6000多元,，且過濾器*是比較容易損壞的設(shè)備,。最主要是過濾片的成本太高，一片就要幾十元,。按一般液相柱的正常使用壽命計算,，過濾片的成本會遠遠高于色譜柱的成本。
?。?）流動相過濾對于工作效率成本不劃算,。使用溶劑過濾器有一個預清洗、裝備,、使用、用后清洗,，晾干的過程,，至少也有一個小時的時間。這個成本也不能忽視。
?。?）在實際工作未發(fā)現(xiàn)流動相不過濾會對柱壽命有任何影響,。我們起碼有6年時間沒有做過流動相過濾的工作，但是和國內(nèi)同行相比較,，在同等使用強度下我們的柱壽命是比較長的,。
“堵”的原因之二：使用流動相時的細菌污染。
指的是：
流動相剛開始沒有長菌,，在使用時卻產(chǎn)生了細菌污染,。這主要是在使用多元液相色譜儀時的一種不良使用習慣造成的。
舉簡單的例子：
50％的甲醇水流動相,，有兩種使用方式,。一種方式是在上機前就配好混合在一起，另一種方式是在流路A放純甲醇,，流路B放純水,。
從單純實驗效果來說，后一種有明顯的優(yōu)點：首先是簡單,，不需要實驗者另個計算配比混合,，其次就是比例準確，能得到保留時間重復性的實驗效果,。
但是,，它有一個致命的缺陷，就是純水在流動相瓶中幾天時間就會長細菌（很多情況下不僅僅用純水作流動相,，而是用緩沖鹽溶液,，本身就是優(yōu)質(zhì)肥料，細菌長得更迅速）,，一旦有細菌柱子就壞得很快,。所以這種方式要求操作人員每次實驗都要用新制備的純水，更要求在每次實驗后把水相換掉,，換成甲醇沖洗干凈,，這一點在實際工作中很多人意識不強，就是意識到了但多次使用中總有一兩次會遺漏,，但是往往這一兩次就足以產(chǎn)生致命的影響,。因為液相色譜柱的堵塞是不可逆的。
所以,，寧可犧牲小小的保留時間的重復性,，也不要用純水溶液作為流動相的一組。從實際實驗效果來說,，我建議用10％的甲醇水代替純水溶液（以前我做過不同比例甲醇水的細菌總數(shù)實驗,，在5％就基本可以抑菌,，在10％及以上就可以*殺菌了），這樣可以有效排除長細菌的隱患,，既可作流動相,，也可沖柱。就算是在配制流動相時會計算得麻煩一些,，但是一次麻煩,，終身受益。
“堵”的原因之三：不適當操作,。
常見問題的有以下幾種：
?。?）在更換零件時選擇的型號有誤，接口不是很匹配,，在擰緊的時候產(chǎn)生變形而使得管路堵塞,。
（2）樣品處理液凈化得不干凈,，長期會在六通閥和柱之間形成阻塞不暢,。
（3）在使用手動六通閥時,，有些人可能由于手勁小的原因,，轉(zhuǎn)動的不到位，于是造成流路形成了死堵,，壓力快速升高超過警戒值,。
（4）在使用金屬管路作出廢液管時,，應(yīng)當注意最好廢液瓶中先放一些水,，并把廢液管的出口端放在液面下。如果位于在液相上且實驗使用較高濃度的緩沖鹽溶液,，在停機時可能在出口端結(jié)晶成塊并造成堵塞,。這種情況不常見，但卻的確發(fā)生過,。
“堵”的原因講了不少,，現(xiàn)介紹查堵的方法。
在發(fā)生“堵”的現(xiàn)象后,，就需要找出原因,，主要是什么位置發(fā)生了“堵”。注意,，絕大多數(shù)情況下,，整個系統(tǒng)只會有一個地方發(fā)生堵塞。
查堵的方法是從尾向前逆向分段拆開,，仔細觀察壓力數(shù)值,，如果某一個部件（柱子除外）裝上和拆下時的壓力差別很大,，可發(fā)展變化判斷,。至于柱的堵塞,，可以通過換同樣規(guī)格的柱的壓力是否一致來判斷。
下面再談一下“漏”的問題,。“漏”分兩種：漏液和漏氣,。
一、漏液
液相色譜儀從流動相瓶到廢液瓶之間的流路是一個全封閉體系,，內(nèi)部壓力很高,，但外部卻能保證一滴不漏。如果某個部件發(fā)生了漏液,，那就是故障所在,。
漏液的原因分兩種：
（1）接觸硬件不當
在更換零件如流路管或換柱時,，換的接頭接口不匹配,，造成漏液。要注意不同公司的柱子接頭很多是不同的,，甚至同一家公司在不同時期生產(chǎn)的液相柱接頭也有很大區(qū)別,。當然選用PEEK接頭是一個較好的解決方法，不僅通用性好,，而且靠手擰就能保證不漏液,。
即使是接口本身是匹配的，但是如果操作不當也會漏液,，一種不當就是力度把握不好,，擰得太緊或太松；另一種不當就是致命的錯誤：滑絲,，這是往往是動手能力不太強,，螺絲釘很少擰的工作者犯的錯誤，滑絲的后果不僅是漏液那么簡單,，常造成重要部件的報廢,。解決這個問題只能靠惡補基本功來實驗，那就是擰螺絲,。
?。?）使用儀器不當
如果是輸送泵漏液，最常見的原因就是在活塞位置緩沖鹽析出造成,。
析出的原因有兩個,，一是使用緩沖鹽溶液時突然加入了純甲醇而析出，這種錯誤很容易避免,，這是盡量不要用純的甲醇和純水,。只要互相有10％的比例就不會出現(xiàn)這個問題,。另一原因是在用緩沖鹽溶液（不論甲醇含量有多少）作流動相時，實驗結(jié)束后沒有換甲醇水沖洗,，使得微滲的流動相干燥形成晶體造成,。
不過，輸送泵漏液并不是非得馬上修不可,，沖洗干凈并在以后的使用中多加小心一般都可以正常使用,。
檢測器漏液是個很麻煩的事，一般都是吸收池的問題,，更換的費用相當高,。但是并不是說一定要馬上更換，還可以從實際實驗效果看能否湊合使用,。
二．漏氣
漏液是從內(nèi)部向外漏,，而漏氣則是外部的氣體進入液相色譜儀的流路內(nèi)部形成了氣泡。下面按流路的方向逐個部件分析產(chǎn)生氣泡的原因和相應(yīng)解決方法,。
1.過濾頭
抽液時,，在流路管中有不規(guī)則但持續(xù)的小氣泡產(chǎn)生，這時考慮的是流動相有沒有脫氣（需要特別提醒即使是有了真空脫氣機也是要先超聲脫氣的,，起碼可以減少脫氣機的工作壓力并提高工作效率）,，如果已經(jīng)脫了氣，則要注意過濾頭的污染也會造成這種現(xiàn)象,。處理方法比較簡單,，擰下過濾頭在稀硝酸中浸泡，超聲半小時,，洗凈后裝回去即可,。
2.透明流路管
指的是在過濾頭和輸送泵之間的那一段管路。這一個部分往往不是有點氣泡,，而經(jīng)常是整個管中全是空氣而操作人員卻渾然不知,，以致輸送泵工作了半天才發(fā)現(xiàn)流動相瓶里的液體一點也沒少。這也是我們常說的液相色譜儀至少一周要開機一次的原因（我們做液相一定要有“微滲”的概念）,。如果長時間不用,，這一段管路的液體會*干掉，而充滿空氣的管路和充滿液體的管路不仔細看是分辨不出的,。
這種情況對于輸送泵很危險,，因為，泵從設(shè)計來說是輸送液體而不是氣體,，內(nèi)部的液體對于活塞來說起到了機油的作用,，如果活塞桿上還殘存了一些緩沖鹽，則極易拉傷,，造成不可逆轉(zhuǎn)的影響,。
對于這種情況,，要突出“預防為主”，如,，液相色譜使用人員要相對固定和穩(wěn)定,，工作中合理搭配資源，每臺機一周擊至少作一次實驗,，如長期不用起碼每周要沖流動相2小時,。養(yǎng)成良好的工作習慣很重要。
如果不慎出現(xiàn)了這種問題怎么辦,？我的建議是用外力使管路中充滿液體。具體如下：
(1)找到流路管進入輸送泵的接頭,。
(2)擰下來,。
(3)用一干凈的洗耳球的對準管路的平整切口。
(4)吸液體,，看液面從流動相瓶里上升,，至離洗耳球5厘米左右時停止該動作。
(5)快速把接頭擰回輸送泵上（這個過程可能會有少許流動相外泄,，這是正?，F(xiàn)象）。
(6)開機,，打開排液閥門,，啟動輸送泵。
(7)等排液管中流出的溶液沒有氣泡時,，再關(guān)閉排液閥,，儀器正常工作。
3.輸送泵和柱子
這些部分進了氣泡一般不怕,，沖掉就行,。
4.檢測器
應(yīng)該說，整個流路中只要有一個氣泡都會在檢測器上得到強烈的信號反映,，檢測器內(nèi)部的氣泡一般都能被沖走,，但也有很難沖掉的殘留氣泡的情況。
如果檢測器里有殘留氣泡,，會有特征明顯的表現(xiàn)形式,，就是在走基線時會時不時間隔出現(xiàn)直上直下信號很大的信號峰。這時先看普通流量能否沖走,，如果沖不走,，那的辦法就是拆柱，把檢測器直接連到輸送泵的出口,，加大幾倍流量沖洗,，則肯定能沖走氣泡,。
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