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實驗原理
試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）,。往預先包被人血管生成素1（ANG-1）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體,，經過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色,，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色,，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人血管生成素1（ANG-1）呈正相關,。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度,。
樣本處理及要求
1. 血清：全血標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于2000g離心20分鐘,，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃或-80℃保存,，但應避免反復凍融,。
2. 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內于2 - 8°C 2000g離心20分鐘，或將標本放于-20℃或-80℃保存,，但應避免反復凍融,。
3. 細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本：2000g離心20分鐘，取上清即可檢測,，或將標本放于-20℃或-80℃保存,，但應避免反復凍融。
注：標本溶血會影響zui后檢測結果,，因此溶血標本不宜進行此項檢測,。
需要而未提供的試劑和器材
- 酶標儀（450nm）
- 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL,、20-200uL,、200-1000uL
- 37℃恒溫箱
- 蒸餾水或去離子水
試劑盒組成
名稱 | 96孔配置 | 48孔配置 | 備注 |
微孔酶標板 | 8孔×12條 | 8孔×6條 | 無 |
標準品 | 0.3mL*6管 | 0.3mL*6管 | 無 |
樣本稀釋液 | 6mL | 3mL | 無 |
檢測抗體-HRP | 10mL | 5mL | 無 |
20×洗滌緩沖液 | 25mL | 15mL | 按說明書進行稀釋 |
底物A | 6mL | 3mL | 無 |
底物B | 6mL | 3mL | 無 |
終止液 | 6mL | 3mL | 無 |
封板膜 | 2張 | 2張 | 無 |
說明書 | 1份 | 1份 | 無 |
自封袋 | 1個 | 1個 | 無 |
備注：
1. 標準品濃度依次為：20、10,、5,、2.5、1.25,、0 ng/mL
2. 經過大量正常標本檢驗,，標本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測范圍內，實驗過程中直接取50μL樣本上樣即可,。當有部分樣本值超過zui大標準品濃度時,，可用樣本稀釋液將標本進行適當稀釋后再進行實驗。
注意事項
- 嚴格按照規(guī)定的時間和溫度進行溫育以保證準確結果,。所有試劑都必須在使用前達到室溫20-25℃,。使用后立即冷藏保存試劑。
- 洗板不正確可以導致不準確的結果,。在加入底物前確保盡量吸干孔內液體,。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。
- 消除板底殘留的液體和手指印,，否則影響OD值,。
- 底物顯色液應呈無色或很淺的顏色，已經變藍的底物液不能使用,。
- 避免試劑和標本的交叉污染以免造成錯誤結果,。
- 在儲存和溫育時避免強光直接照射。
- 平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上,。
- 任何反應試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強烈氣體,。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應試劑的生物活性。
- 不能使用過期產品,。
- 如果可能傳播疾病,，所有的樣品都應管理好,，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。
試劑準備
試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡后方可使用,。
20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋,，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。
操作步驟
- 從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,，剩余板條用自封袋密封放回4℃,。
- 設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL,；
- 樣本孔中加入待測樣本50μL,；空白孔不加。
- 除空白孔外,，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL,，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min,。
- 棄去液體,，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL）,，靜置1min,，甩去洗滌液，吸水紙上拍干,，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）,。
- 每孔加入底物A、B各50μL,，37℃避光孵育15min,。
- 每孔加入終止液50μL，15min內,，在450nm波長處測定各孔的OD值,。
實驗結果計算
以所測標準品的OD值為橫坐標，標準品的濃度值為縱坐標,，在坐標紙上或用相關軟件繪制標準曲線,，并得到直線回歸方程，將樣品的OD值代入方程,，計算出樣品的濃度,。
試劑盒性能
- 檢測范圍：0.625 ng/mL – 20 ng/mL。
- 靈敏度：zui低檢測濃度小于0.1 ng/mL,。
- 特異性：不與其它可溶性結構類似物交叉反應,。
- 重復性：板內變異系數(shù)小于10% ，板間變異系數(shù)小于15% ,。
