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皮質(zhì)醇ELISA試劑盒常見的定量方法
測(cè)定原理：現(xiàn)在皮質(zhì)醇ELISA試劑盒除非是測(cè)定抗體的以外,，一般使用的是雙抗體夾心法，此種方法大多數(shù)用的是增強(qiáng)的雙抗體夾心法，即使用生物素-親和素系統(tǒng),，還有少數(shù)的指標(biāo)可能使用競(jìng)爭(zhēng)法,，這類方法適用于半抗原的測(cè)定,。
具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的多表位蛋白抗原,，其雙抗體夾心法中的一個(gè)抗體必須用單抗，否則背景很高,。當(dāng)然如果兩個(gè)都是單抗(這兩個(gè)單抗針對(duì)不同表位),，那么測(cè)定的線性范圍就較寬，試劑盒性能就較好,；一個(gè)用單抗,，一個(gè)用多抗，測(cè)定的靈敏度會(huì)較高,。
某些簡(jiǎn)單的化合物用皮質(zhì)醇ELISA試劑盒測(cè)定時(shí),，因?yàn)闆]有兩個(gè)或以上的表位，一般只能作為半抗原,，只能用競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定,。如果你發(fā)現(xiàn)有測(cè)定簡(jiǎn)單化合物(如雌激素、NO,、地高辛等)用雙抗體夾心法作測(cè)定原理時(shí),，這個(gè)試劑盒你就要懷疑了。另外還要說明一步雙抗體夾心法與兩步雙抗體夾心法的區(qū)別,。
一步雙抗體夾心法的吸光度-劑量曲線呈鐘形,，隨著待則標(biāo)本中抗原濃度的增加而升高至一定程度后，測(cè)定吸光度即隨抗原濃度的增加而開始下降直至不顯色,，即所謂的“鉤狀效應(yīng)”(hookeHect)，也就是我們?cè)诿庖叱恋碓囼?yàn)中所稱的“帶現(xiàn)象”(zonephenomenon),。所以當(dāng)使用一步雙抗體夾心法時(shí),，樣品濃度太高，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)測(cè)不出來的現(xiàn)象,，此時(shí)要作適當(dāng)?shù)南♂尣拍軠?zhǔn)確測(cè)定,。
皮質(zhì)醇ELISA試劑盒的組成：用雙抗體夾心法作為測(cè)定的方法時(shí)，試劑盒的組成一般包括：已包被單抗的酶標(biāo)板：一塊,，有96孔的,，也有48孔的,，可拆缷，外面有鋁箔袋密封,，打開后有干燥劑,，實(shí)驗(yàn)時(shí)暫未使用的酶標(biāo)條要連帶干燥劑密封好，放在4℃冰箱中妥善保存,。
皮質(zhì)醇ELISA試劑盒操作步驟
1,、準(zhǔn)備：從冰箱取出試劑盒，室溫復(fù)溫平衡30分鐘,。
2,、配液：用蒸餾水將20倍濃縮洗滌液稀釋成原倍的洗滌液。
3,、加標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣本：取足夠數(shù)量的酶標(biāo)包被板,，固定于框架上，分別設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔,、待測(cè)樣本孔和空白對(duì)照孔,，記錄各孔位置，在標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品50μL,；待測(cè)樣本孔中先加入待測(cè)樣本10μL,，再加樣本稀釋液40μL（即樣本稀釋5倍）；空白對(duì)照孔不加,。
4,、溫育：37℃水浴鍋或恒溫箱溫育30min。
5,、洗板：棄去液體,，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液,，靜置1min,，甩去洗滌液，吸水紙上拍干,，如此重復(fù)洗板4次（也可用洗板機(jī)按說明書操作洗板）,。
6、加酶標(biāo)工作液：每孔加入酶標(biāo)工作液50μL,，空白對(duì)照孔不加,。
7、溫育：重復(fù)4的操作,。
8,、洗板：重復(fù)5的操作。
9,、顯色：每孔先加入顯色劑A 液50μL,，再加入顯色劑B液 50μL,，37℃避光顯色15min。
10,、終止：取出酶標(biāo)板,，每孔加終止液50μL，終止反應(yīng)（顏色由藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）,。
11,、測(cè)定：以空白孔調(diào)零，在終止后15分鐘內(nèi),，用450nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的吸光值（OD值）,。
12、計(jì)算：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的OD值,，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程,，再根據(jù)樣本的OD值，在回歸方程上計(jì)算出對(duì)應(yīng)的樣品濃度,，也可以使用各種應(yīng)用軟件來計(jì)算,。zui終濃度為實(shí)際測(cè)定濃度乘以稀釋倍數(shù)。
