自噬作為藥物治療的一個有前景的靶標

自噬及其失調(diào)已被發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)退行性疾病和癌癥中發(fā)揮著重要作用,，因此,，在這個過程中發(fā)現(xiàn)新的治療靶標已成為一種有前景的藥物治療方法。自噬是一種在細胞應(yīng)激下降解和回收受損蛋白和細胞器的調(diào)控過程1,，2。被稱為自噬體的囊泡通過在標記為破壞的細胞成分周圍形成雙膜來進行組裝1。自噬體囊泡隨后與溶酶體融合,，傳遞其內(nèi)容物以供溶酶體水解酶降解。

自噬具有多種復(fù)雜的生理和病理生理作用,，例如適應(yīng)營養(yǎng)饑餓,、清除受損的細胞內(nèi)蛋白和細胞器、細胞發(fā)育,、抗老化,、消除微生物、細胞死亡,、腫瘤抑制和抗原呈遞2,。線粒體分裂是自噬對線粒體的選擇性降解3。該過程通?？?/span>以消除細胞損傷或應(yīng)激后有缺陷的線粒體,。

Materials

•  PC12人神經(jīng)母細胞瘤細胞系（ATCC）

•  384 孔板（Greiner）

•  CYTO-ID® 自噬檢測試劑盒（ENZO Life Sciences）

•  橙色線粒體染料

•  Hoechst 33342

•  ImageXpress® Pico自動化細胞成像系統(tǒng)（Molecular Devices）

•  CellReporterXpress 數(shù)據(jù)采集和分析軟件（Molecular Devices）

優(yōu)勢

定量化合物對自噬過程的影響

使用核標記物分割細胞，檢測和表征小的目標物

使用自動成像確?？煽康慕y(tǒng)計結(jié)果

使用自動細胞成像檢測和定量自噬體顆粒

評估對自噬的影響

這篇應(yīng)用說明中,，我們評估了ImageXpress Pico自動化細胞成像系統(tǒng)檢測和定量自噬體顆粒的效率。PC12人神經(jīng)細胞瘤細胞系被用作檢測開發(fā)模型,。將細胞以 6,，000 個細胞/孔接種到384孔板中，孵育48小時,。為了評估對自噬的影響,，使用不同濃度的氯喹或維拉帕米處理細胞48小時。維拉帕米可以誘導(dǎo)自噬,，而氯喹可以抑制導(dǎo)致顆粒累積的自噬體降解,。化合物處理后，使用CYTO-ID®自噬檢測試劑盒對活細胞進行染色,，以示蹤自噬體,。此外,，我們使用熒光線粒體染料檢測線粒體，并使用Hoechst識別細胞核（濃度分別為 0.2 μM 和 1 μM）,。使用搭配20X或40X物鏡的ImageXpress Pico系統(tǒng)以及三個檢測通道（FITC,、TRITC 和 DAPI）對細胞進行成像。在 20X物鏡下每個孔采集一張圖像,，在40X物鏡下每個孔采集2-4張圖像,，以確保可靠的統(tǒng)計結(jié)果,。使用CellReporterXpress圖像采集和分析軟件中的自噬或線粒體應(yīng)用方案分析圖像,。

圖 1：自噬體檢測。上圖顯示了經(jīng)過自噬誘導(dǎo)劑氯喹（30 pM）處理并使用Cyto-ID染料染色的PC12細胞的代表性自噬細胞圖像和分析掩膜,。在CellReporterXpress軟件中,，使用點分割識別自噬顆粒。細胞核顯示為藍色,、線粒體顯示為橙色,，自噬顯示為綠色。下圖顯示了使用橙色線粒體完整性染料對未處理細胞進行染色,。用于線粒體檢測的圖像和分析掩膜,。。

這些算法可以檢測和表征小的目標物,，如細胞質(zhì)中的自噬體或線粒體,，同時使用核標記來分割細胞。用于檢測自噬的定量檢測包括顆?？倲?shù)或平均數(shù),、顆粒（亞細胞對象）的總面積或平均面積以及強度。用氯喹（30 μM）處理后細胞的代表性圖像和分析掩膜如圖1所示,。檢測氯喹和維拉帕米處理后細胞的濃度反應(yīng),，并評估EC50值?？傋允审w計數(shù)的數(shù)據(jù)表明,，氯喹和維拉帕米處理使細胞自噬水平分別增加4.6倍和3.3倍（EC50值分別為4.0和3.6 μM）。

結(jié)論

該方法與CYTO-ID染料結(jié)合可用于檢測自噬顆粒,，并可用于檢測開發(fā)和定量化合物對自噬過程的影響,。

參考文獻

1.       1. Mizushima, N; Komatsu, M (2011). Autophagy: renovation of cells and tissues. Cell. 147: 728–41

2.       2. Mizushima, N; (2007). Autophagy: process and function, Genes & Dev. 21: 2861-2873