簡介

對于監(jiān)測細胞數(shù)目、繁殖、健康,、融合度和細胞毒性的多種生物學應用，需要進行無標記細胞檢測,。這些應用需要使用有效和可靠的透射光(TL)成像和分析功能,，此功能可提供精確分割以定量細胞并評估各種細胞反應和形態(tài)。此外,，高對比度透射光成像與熒光標記成像的結合對于許多基于細胞的檢測分析來說是非常重要的,。

MetaXpress 6.5自定義模塊編輯器中的TL 細胞分割算法是一種使用透射光對細胞進行成像及定量的優(yōu)化且可靠的分析算法。此應用說明展示了TL細胞分割的實用性和準確性,。通過將透射光中的總細胞計數(shù)與熒光染色的細胞核計數(shù)進行比較來分析和定量 CHO和HeLa細胞的算法（圖 1）,。

方法

將CHO和HeLa細胞稀釋液接種到黑色、底部透明的96孔板中,，從板頂行開始布板（最頂行中每孔20,，000個細胞）。將每種細胞按1：2的比例在微孔板中向下進行稀釋,，6個復孔,。細胞培養(yǎng)24小時后，在 37°C,、5% CO2 的培養(yǎng)箱中用Hoechst 33342細胞核染料對細胞染色30分鐘,。然后用4%多聚甲醛固定細胞，并用DPBS洗滌兩次,。通過ImageXpress® Micro高內(nèi)涵成像系統(tǒng)和MetaXpress軟件對細胞進行成像,。使用10x Plan Fluor物鏡對一個視野進行成像，該物鏡可準確捕獲多達1500個細胞,。使用透射光和DAPI熒光通道拍攝圖像,，曝光時間分別為15 ms和35 ms。

優(yōu)勢

使用
透射光成像對目標物進行分割和計數(shù)監(jiān)測透射光下的細胞增殖

使用多種分析方法評估TL細胞分割算法的效果

了解多種細胞類型和大小的量化工具
定量和分析工具

圖 1：設置用于分析透射光下拍攝的HeLa和CHO細胞圖像的自定義模塊,。 使用Hoechst 33342細胞核染料對細胞進行染色,。使用DAPI通道和透射光 (TL) 進行細胞成像,，設置自定義模塊以根據(jù)透射光成像和細胞核熒光成像分析和定量細胞。

在自定義模塊編輯器中設置TL細胞分割算法

精準的細胞分割對于定量通過透射光捕獲的細胞而言非常重要,。為TL細胞分割選擇的細胞算法A可以精確地分割和識別HeLa和CHO細胞 （圖 2）,。還有其他設置可供選擇。細胞算法B或細胞算法C可分別用于分析小細胞或大細胞,。在分析模塊中進行設置可以過濾總面積小于150 pM2的細胞（圖 3）。這個設置可以確保避免將圍攏的小型死細胞當做活細胞進行計數(shù)和分析,。此外,，經(jīng)過設置的細胞核計數(shù)算法可以準確定量HeLa和CHO的細胞核（圖 4）。

結合透射光下的細胞計數(shù)與熒光胞核計數(shù)

使用TL細胞分割算法設置的自定義模塊可精確分割HeLa和CHO 細胞（圖 6）,。透射光中的總細胞計數(shù)和細胞核計數(shù)沒有統(tǒng)計學差異,，表明TL細胞分割算法的準確性（圖 7）。除細胞計數(shù)外,，TL細胞分割算法還可生成多個數(shù)據(jù)以評估細胞反應和細胞形態(tài)的不同特征（圖 5）,。例如，可生成細胞和細胞內(nèi)目標物的總計數(shù)和平均計數(shù),、面積,、強度、形狀,、高度,、寬度以及各種其他不同的讀數(shù)。使用過濾器選項去除圍攏的死細胞可進一步優(yōu)化此過程,，并減少使用活細胞或全細胞染色的必要性,。此外，細胞核染色和計數(shù)細胞核對象算法的使用展現(xiàn)了可通過分析透射光成像,。

圖 2. 將TL細胞分割算法應用于選定的HeLa細胞透射光圖像,。在自定義模塊編輯器中，可以通過設置選擇源波長和代表細胞類型對TL細胞分割算法進行配置,。細胞算法A可以有效地識別圖像中的HeLa和CHO細胞,。

圖 3. TL細胞分割疊加和過濾器設置篩選后疊加的比較圖像。 將最小面積設置為150 μm2以過濾掉死細胞,。

圖 4. 使用細胞核對象分割模塊對熒光細胞核圖像進行計數(shù),。根據(jù)細胞核對細胞進行定量，使用Hoechst 33342對細胞核進行染色,。對超過局部背景參數(shù)的最小和最大寬度估值和強度進行優(yōu)化,，以精準識別所有細胞核。細胞核為藍色（左圖）,，分析遮蔽為黃色（右圖）,。

圖 5. HeLa細胞的代表性圖像,，設置自定義模塊圖像分析方法。 藍色遮蔽代表通過TL細胞分割算法使用TL過濾器遮蔽篩選發(fā)現(xiàn)的細胞,，黃色代表通過計數(shù)核對象算法發(fā)現(xiàn)的細胞核,。自定義模塊的所需測定項可在測定選項卡中進行設置。需要測定的對象被定義為可以通過TL細胞分割算法進行遮蔽的對象,，選擇計數(shù)核對象遮蔽測定每個目標物的特性,。

圖 6. HeLa和CHO細胞的圖像，以及應用TL細胞分割自定義模塊優(yōu)化后的圖像分析結果,。DAPI 細胞核以藍色顯示（左）,，在圖像分析中掩膜為黃色（右），透射光中的細胞以淺藍色掩膜,。通過10x Plan Fluor物鏡在ImageXpress Micro系統(tǒng)上捕獲圖像,，并使用新TL細胞分割算法配置的自定義模塊對圖像進行分析。

圖 7. 基于TL細胞分割和核計數(shù)對象模塊比較HeLa和CHO細胞的總細胞計數(shù),。 按1：2的比例稀釋細胞,，從每孔20，000個細胞的濃度開始,。

結論

MetaXpress自定義模塊編輯器中的TL細胞分割算法可以有效定量和分析多種細胞類型和大小,。ImageXpress® Micro Confocal轉盤共聚焦高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)支持的優(yōu)化分割功能可分析與熒光團無關的細胞形態(tài)學。使用透射光圖像定量細胞可以使研究人員的檢測能力更加靈活,。此應用說明描述的方法展現(xiàn)了TL細胞分割算法可用于多種檢測,，包括但不限于增殖、細胞毒性研究和轉染,。