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在使用PBS的過(guò)程中要特別注意避免溶液被微生物污染,。PBS在低溫情況下可能會(huì)產(chǎn)生沉淀。如果發(fā)現(xiàn)有沉淀產(chǎn)生,，請(qǐng)置于37℃水浴至溶解后再使用,。為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作,。

使用說(shuō)明：
1. 準(zhǔn)備工作：
a. 裂解液溶解后混勻并置于冰浴上備用,。
b. 檢測(cè)緩沖液溶解后混勻并置于冰浴上備用。
2. 測(cè)定pNA標(biāo)準(zhǔn)曲線：
a. 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的配制：按照每0.9ml檢測(cè)緩沖液加入0.1ml裂解液的比例配制適量的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液,。
b. 把試劑盒提供的pNA (10mM)用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋為0,、10、20,、50,、100和200μM，作為標(biāo)準(zhǔn)品,。
c. 每個(gè)濃度取100μl用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè),，或取適當(dāng)量用容量不超過(guò)100μl的分光光度檢測(cè)杯進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定A405,。
d. 每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的A405減去不含pNA的空白對(duì)照的A405計(jì)算出實(shí)際的因pNA而導(dǎo)致的吸光度,，并制作出pNA濃度相對(duì)于A405的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
3. 樣品的收集：
a. 對(duì)于懸浮細(xì)胞：把沒有誘導(dǎo)凋亡的對(duì)照樣品和誘導(dǎo)凋亡的樣品,，600g 4oC離心5分鐘收集細(xì)胞,，小心吸除上清,，同時(shí)確保盡量沒有細(xì)胞被吸除，PBS洗滌一次,。同前吸盡上清后,，按照每200萬(wàn)細(xì)胞加入100微升裂解液的比例加入裂解液，重懸沉淀,，冰浴裂解15分鐘。下轉(zhuǎn)步驟3d,。
b. 對(duì)于貼壁細(xì)胞：吸取細(xì)胞培養(yǎng)液,，備用。用消化貼壁細(xì)胞,，并收集至備用的細(xì)胞培養(yǎng)液中,。600g 4oC離心5分鐘收集細(xì)胞，小心吸除上清,，同時(shí)確保盡量沒有細(xì)胞被吸除,，PBS洗滌一次。同前吸盡上清后,，按照每200萬(wàn)細(xì)胞加入100微升裂解液的比例加入裂解液,，重懸沉淀，冰浴裂解15分鐘,。下轉(zhuǎn)步驟3d,。
c. 對(duì)于組織樣品：按照每3-10mg組織加入100微升裂解液的比例加入裂解液，在冰浴上用玻璃勻漿器勻漿,。然后把勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中,，冰浴再裂解5分鐘。
d. 4oC 16,000-20,000g離心10-15分鐘,。
e. 把上清轉(zhuǎn)移到冰浴預(yù)冷的離心管中,。
f. 立即測(cè)定caspase 3/7的酶活性或-80oC保存樣品。同時(shí)可以取少量樣品用Bradford法測(cè)定蛋白濃度,，盡量使蛋白濃度達(dá)到1-3mg/ml,，相當(dāng)于每10微升待測(cè)樣品中至少含有10-30μg蛋白。如果細(xì)胞較少,，可以適當(dāng)增加細(xì)胞的用量,。
4. Caspase 3/7酶活性的檢測(cè)：
a. 取出適量的Ac-DEVD-pNA (2mM)，置于冰浴上備用,。
b. 如下設(shè)置反應(yīng)體系：
注意：在設(shè)置反應(yīng)體系時(shí)先加檢測(cè)緩沖液,，再加待測(cè)樣品，適當(dāng)混勻,，注意避免在混勻時(shí)產(chǎn)生氣泡,。隨后再加入10μl Ac-DEVD-pNA (2mM),。

c. 加入Ac-DEVD-pNA (2mM)后混勻，注意避免在混勻時(shí)產(chǎn)生氣泡,。37oC孵育60-120分鐘,。發(fā)現(xiàn)顏色變化比較明顯時(shí)即可測(cè)定A405。如果顏色變化不明顯,，可以適當(dāng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間,，甚至可以孵育過(guò)夜。
d. 樣品的A405扣除空白對(duì)照的A405,，即為樣品中caspase 3/7催化產(chǎn)生的pNA產(chǎn)生的吸光度,。通過(guò)同步驟1中獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比就可以計(jì)算出樣品中催化產(chǎn)生了多少量的pNA。
e. 參考Chemicon公司的caspase 3/7酶活力單位的定義：One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0nmol of the colorimetric substrate Ac-DEVD-pNA per hour at 37oC under saturated substrate concentrations,。即一個(gè)酶活力單位定義為當(dāng)?shù)孜镲柡蜁r(shí),，在37oC一個(gè)小時(shí)內(nèi)可以剪切1nmol Ac-DEVD-pNA產(chǎn)生1nmol pNA的caspase 3/7的酶量。這樣就可以計(jì)算出樣品中含有多少個(gè)酶活力單位的caspase 3/7,。說(shuō)明：在本試劑盒的檢測(cè)體系中,，底物的起始濃度為0.2mM，此時(shí)底物是飽和的,，對(duì)于許多樣品而言在37oC孵育2個(gè)小時(shí)以內(nèi)底物都是飽和的,；對(duì)于樣品中caspase 3/7酶活力特別高的情況，須用裂解液適當(dāng)稀釋樣品后再進(jìn)行測(cè)定,。
f. 用Bradford法檢測(cè)待測(cè)樣品中的蛋白濃度(由于裂解液中含有較高濃度的DTT,，不適合采用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定)。這樣就可以計(jì)算出一個(gè)樣品單位重量蛋白中所含的caspase 3/7的酶活力單位,。

CPP32,Yama,apopain,caspase-3,caspase 3,Activated caspase-3/7,Cleaved caspase-3/7,caspase-3/7

-20℃保存,，Ac-DEVD-pNA和pNA需要避光保存。有效期12個(gè)月,。