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描述：

人正常腸類器官培養(yǎng)基可應(yīng)用于人正常腸來源類器官的常規(guī)培養(yǎng)傳代，能夠保持其傳代后的生長活力,，類器官培養(yǎng)過程中,，不用添加任何其他蛋白因子。

使用方法：

1,、原代 
（1）取材后的組織放在預(yù)冷的（2-8°C）組織保存液的取樣瓶中,，快速轉(zhuǎn)運至潔凈實驗室進行組織處理和細胞分離，拍照并登記信息,。
（2）準(zhǔn)備若干培養(yǎng)皿,，加入 4℃預(yù)冷的人正常腸類器官組織原代培養(yǎng)緩沖液#abs9731備用。
（3）取樣瓶消毒,，將組織放入培養(yǎng)皿中,，利用人正常腸類器官組織原代培養(yǎng)緩沖液清洗三次后，利用眼科剪或手shu刀將組織jian切成體積約為 1-3mm3的組織塊,。
（4）組織用消化液#abs9749消化,，4℃震蕩消化10-20min，（消化過程中隨時觀察消化情況）,。
（5）取少量液體在顯微鏡下觀察,，鏡下觀察到較多的單個細胞或 70um 以下的細胞簇后,，加入三倍體積人正常腸類器官組織原代培養(yǎng)緩沖液終止消化。
（6）使用100um孔徑的篩網(wǎng)進行過濾,，將濾液收集后,，于300g富集離心5min后移去上清，添加人正常腸類器官組織原代培養(yǎng)緩沖液重新重懸離心,。
（7）基質(zhì)膠計算：第6步后觀察收集到的組織體積,，添加25倍組織體積的基質(zhì)膠#abs9495 重懸鋪板。
（8）24孔細胞培養(yǎng)板為例,，每孔點膠25ul組織基質(zhì)膠混合物進行鋪板（4℃下操作）,。
（9）將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中10-15min成膠，添加人正常腸類器官培養(yǎng)基（恢復(fù)室溫）進行培養(yǎng),。

2,、類器官傳代培養(yǎng)
（1）移液槍吸去培養(yǎng)基，每孔添加1-2ml 4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液#abs9730放置2min,。
（2）移液槍輕柔吹打基質(zhì)膠,，收集在15ml離心管中，4℃靜置10min,。（每6-8孔為一組）
（3）a：類器官數(shù)量不足或體積較小時： 離心5min棄去上清,，添加適量人正常腸類器官傳代培養(yǎng)緩沖液重懸移入1.5ml離心管，300g離心5min棄去液體進行第4步,。
         b：類器官數(shù)量較多或體積較大時：離心5min棄去上清,，添加適量類器官傳代消化液#abs9520 消化2-3min，添加人正常腸類器官傳代培養(yǎng)緩沖液終止消化,，離心5min棄去混合液,，添加適量人正常腸類器官傳代培養(yǎng)緩沖液重懸移入1.5ml離心管，300g離心5min棄去液體進行第4步,。
（4）類器官收集后,，添加基質(zhì)膠重懸，每孔25ul基質(zhì)膠鋪在24孔細胞培養(yǎng)板中,，放置培養(yǎng)箱中10-15min添加500ul人正常腸類器官培養(yǎng)基,。

3、類器官凍存
（1）移液槍吸去培養(yǎng)基,，每孔添加1-2ml 4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液放置2min,。
（2）移液槍輕柔吹打基質(zhì)膠，收集在15ml離心管中,，4℃靜置10min,。（每6-8孔為一組）
（3）離心5min棄去上清，添加適量人正常腸類器官傳代培養(yǎng)緩沖液再次重懸，300g離心5min棄去液體,。
（4）添加適量類器官凍存液#abs9519,，輕柔吹打重懸，以24孔細胞培養(yǎng)板為例：密度為2個孔凍存1管,，每管體積1.4ml,。
（5）做好標(biāo)記信息，進行程序降溫后,，移入液氮長期保存,。

4、類器官復(fù)蘇
（1）取10ml人正常腸類器官傳代培養(yǎng)緩沖液于15ml離心管中,。
（2）從液氮罐中取出凍存的類器官細胞,，快速置于 37℃水浴鍋中融解。
（3）水浴融解過程中,，需輕輕搖動冷凍管,，以確保凍存液在 1-2min內(nèi)融解。
（4）將溶解后的類器官細胞快速轉(zhuǎn)移至15ml 離心管,，使用移液管輕輕吹打6-8次,，300g 離心 5min，然后除去上清液并收集類器官細胞沉淀,。添加適量人正常腸類器官傳代培養(yǎng)緩沖液重懸移入1.5ml離心管300g離心5min,。
（5）基質(zhì)膠重懸，每孔25ul基質(zhì)膠鋪在24孔細胞培養(yǎng)板中,，放置培養(yǎng)箱中10-15min成膠,，添加500ul人正常腸類器官培養(yǎng)基。