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描述：

在正常細(xì)胞中,，磷脂酰絲an酸只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，細(xì)胞發(fā)生凋亡最早期，膜磷脂酰絲an酸（PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè),，這一變化早于細(xì)胞皺縮,、染色質(zhì)濃縮、DNA片斷化和細(xì)胞膜的通透性增加等凋亡現(xiàn)象,。Annexin V是一種磷脂結(jié)合蛋白,，與磷脂酰絲an酸有高度親和力，故可通過細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲an酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合,。因此Annexin V被作為檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一,。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一種核酸染料, 它不能透過完整的細(xì)胞膜，但凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞由于細(xì)胞膜通透性的增加,，PI 能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅,。因此將Annexin V 與PI 匹配使用，就可以將處于不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞區(qū)分開來,。

操作步驟：

貼壁細(xì)胞需用 0.25%的yi酶消化,。注意過度消化可損傷細(xì)胞。在消化時(shí)可加 2％的BSA可防止消化過度,。如果用含EDTA的yi酶消化時(shí),，注意必須清除EDTA：在標(biāo)記前用 1×PBS或 1×binding buffer洗滌，清除EDTA,，以免殘余的EDTA與Ca2+螯合,，影響Annexin V的結(jié)合。
（1） 用去離子水將 10×Binding Buffer 稀釋成 1×Binding Buffer,；
（2） 細(xì)胞收集：懸浮細(xì)胞收集：離心 5 分鐘,；貼壁細(xì)胞：用不含EDTA的yi酶消化收集后（ 注：yi酶消化時(shí)間不宜過長(zhǎng)，否則會(huì)影響細(xì)胞膜上磷脂酰絲an酸與Annexin V-FITC 的結(jié)合）,，在室溫中,，2000rpm 離心 5～10 分鐘，收集細(xì)胞,；
（3） 細(xì)胞洗滌：用預(yù)冷 1×PBS（4℃）重懸細(xì)胞一次,，2000rpm 離心 5～10分鐘，棄上清洗滌細(xì)胞,；
（4） 加入 300μL 的 1×Binding Buffer 懸浮細(xì)胞,；
（5） Annexin V-FITC 標(biāo)記：加入 5μL 的 Annexin V-FITC 混勻后，避光,，室溫孵育 15 分鐘,；
（6） PI 標(biāo)記：上機(jī)前 5 分鐘再加入 5μL 的 PI 染色。
（7） 上機(jī)前,，補(bǔ)加 200μL 的 1×Binding Buffer,。
注意：每個(gè)反應(yīng)體系建議細(xì)胞數(shù)為1×104至1×106個(gè)

操作說明：

（1） 使用前低速離心,，以免液體積存管蓋和管壁；
（2） 本試劑只適用于實(shí)驗(yàn),，不適用于臨床檢測(cè),；
（3） PI（propidium iodide，溴化丙錠）有毒性,，能通過皮膚吸收,，對(duì)眼睛有刺激作用，使用時(shí)需戴手套,；
（4） Annexin V-FITC 和 PI 是光敏物質(zhì),，在操作時(shí)請(qǐng)注意避光。在處理和標(biāo)記時(shí),，盡可能在暗處進(jìn)行,。在孵育階段，用鋁箔包裹容器或置于抽屜中,。細(xì)胞標(biāo)記后,，在暗室內(nèi)用顯微鏡觀察；
（5） 整個(gè)操作過程動(dòng)作要盡量輕柔,，勿用力吹打細(xì)胞,，盡量在 4℃下操作，以免影響細(xì)胞狀態(tài),。
（6） 在細(xì)胞洗滌的最后一步,，請(qǐng)盡量將上清棄凈，以免 PBS 殘留,，有可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,。
（7） 為防止熒光衰變，宜在 1 小時(shí)內(nèi)進(jìn)行流式檢測(cè),。
（8） PI 染色時(shí)間過長(zhǎng)有可能造成檢測(cè)的凋亡率偏高,，建議首先進(jìn)行Annexin V-FITC 染色，最短可在上機(jī)前 5 分鐘再加入 PI 染色,。