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IPS誘導(dǎo)腸類(lèi)器官培養(yǎng)分為三大階段：人多能干細(xì)胞的培養(yǎng),、內(nèi)胚層分化及中/后腸模式化誘導(dǎo)、類(lèi)器官培養(yǎng),。

類(lèi)器官培養(yǎng)（14-28天）

原代

一,、準(zhǔn)備工作

試劑耗材

人正常腸類(lèi)器官培養(yǎng)試劑盒(abs9545)，基質(zhì)膠（低因子,、無(wú)酚紅）(abs9495),，15ml離心管(abs7102)，1.5ml EP管若干(abs7119),，24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(abs7035),、金屬冰盒。

二,、操作流程

1,、加膠-點(diǎn)板-加液（這里是整個(gè)原代操作的點(diǎn)睛之筆）

（1）準(zhǔn)備工作

a 基質(zhì)膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過(guò)夜融化；

b 槍頭,、離心管需要-20℃提前預(yù)冷至少半小時(shí),；

c 融化后的基質(zhì)膠可一直放4℃儲(chǔ)存，建議2周內(nèi)用完,。

低溫金屬冰盒（abs7289）

（2）接種要求

24孔板(abs7035),，每孔25ul基質(zhì)膠球狀體混合物，500-750uL類(lèi)器官培養(yǎng)基,。

（3）接種密度

密度建議1：基質(zhì)膠總體積：球狀體總體積=25:1（如果估摸細(xì)胞團(tuán)沉淀體積困難,，通常加300uL基質(zhì)膠足夠）

密度建議2：50個(gè)球狀體/25uL基質(zhì)膠（如果想計(jì)數(shù)接種，可以參照此密度建議）

（4）加膠-點(diǎn)板

向細(xì)胞團(tuán)沉淀加入基質(zhì)膠(abs9495),，進(jìn)行吹打混勻（不要滿吹滿打,，容易產(chǎn)生氣泡），然后進(jìn)行點(diǎn)板,。整個(gè)操作在金屬冰盒或冰上進(jìn)行,。操作熟練以后，加膠,，混勻,，點(diǎn)板控制在半分鐘內(nèi)，有利于保持基質(zhì)膠良好的流暢性,。

（5）加液

將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中40-60min成膠,，添加500-750μl類(lèi)器官培養(yǎng)基A進(jìn)行培養(yǎng),。大概10-14天，多數(shù)類(lèi)器官直徑在200um-500um,，可進(jìn)行傳代操作,。

鋪板密度

小腸類(lèi)器官生長(zhǎng)圖

傳代（消化分兩種情況）

一、類(lèi)器官數(shù)量較多或體積較大傳代步驟

1,、類(lèi)器官收集及洗滌

1）收集：移液器吸去培養(yǎng)基,，每孔添加1-2ml左右4℃類(lèi)器官傳代培養(yǎng)緩沖液G，輕柔吹散基質(zhì)膠,，收集在15ml離心管中(24孔板,，每5孔為一組)。

2）洗滌：加類(lèi)器官傳代培養(yǎng)緩沖液G定容至14ml（緩沖液越多,，基質(zhì)膠被稀釋的越充分,，越容易去除），4℃靜置 40min或-20℃放置5min（目的是使基質(zhì)膠軟化,，如果冰箱保溫效果強(qiáng)，縮短冷凍時(shí)間,，摸索合適的冷凍時(shí)間時(shí),，可取出離心管搖晃看不到基質(zhì)膠說(shuō)明冷化好了）。

3）接下來(lái)將離心管進(jìn)行300g,，4℃,， 離心5min，離心完通常會(huì)有這兩種情況：

第一種是正常情況,，分成三層（如下圖）,，此時(shí)棄掉上清和基質(zhì)膠層，保留類(lèi)器官沉淀即可,。

第二種是不正常情況,，分成兩層（如下圖），這種情況可能與冷化不充分有關(guān),。此時(shí)棄掉緩沖液,，留下基質(zhì)膠類(lèi)器官混懸液，重復(fù)上一步洗滌步驟,，再次冷化離心,，通常能出現(xiàn)清晰分層（緩沖液層、基質(zhì)膠層,、類(lèi)器官沉淀層）,，此時(shí)棄掉上清和基質(zhì)膠層，保留類(lèi)器官沉淀即可,。如果依然是兩層（緩沖液層和基質(zhì)膠類(lèi)器官混懸液層）,，此時(shí)棄掉緩沖液和上1/3的基質(zhì)膠類(lèi)器官混懸液,，保留下2/3即可。

促進(jìn)基質(zhì)膠和類(lèi)器官有效分離條件：

a離心機(jī)的選擇非常重要,，水平角離心機(jī)相比固定角離心機(jī)更利于基質(zhì)膠和類(lèi)器官分離,；

b離心機(jī)的溫度最好是4℃（可避免基質(zhì)膠固化），離心轉(zhuǎn)速可適當(dāng)提高（最高不要超過(guò)500g）,，離心時(shí)間可適當(dāng)加長(zhǎng)（最常不超過(guò)10min）,。

2、類(lèi)器官消化

1）添加2-3mL類(lèi)器官傳代消化液D于超凈臺(tái)內(nèi)消化2-3min,，消化期間吹打1-2次,。此步驟以消化成細(xì)胞團(tuán)為主，千萬(wàn)不要消化成單細(xì)胞,，單細(xì)胞類(lèi)器官存活率低,。如果不確定是否消化適宜，可吸取數(shù)微升鏡下觀察,，如果有較多細(xì)胞團(tuán)可停止消化,。

2）添加5倍類(lèi)器官傳代培養(yǎng)緩沖液G（緩沖液：消化液=5:1）終止消化，300g 4℃ 離心 5min 棄去上清（如果有基質(zhì)膠殘留,，殘留量<50ul正常,，不影響傳代類(lèi)器官增殖）

3、加膠-點(diǎn)板-加液

（1）準(zhǔn)備工作

a 基質(zhì)膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過(guò)夜融化,；

b 槍頭,、離心管需要-20℃提前預(yù)冷至少半小時(shí)；

c 融化后的基質(zhì)膠可一直放4℃儲(chǔ)存,，建議2周內(nèi)用完,。

（2）接種要求

24孔板(abs7035)，每孔25ul基質(zhì)膠細(xì)胞團(tuán)混合物,，500-750uL類(lèi)器官培養(yǎng)液,。

（3）接種密度

密度建議1： 類(lèi)器官通常按1:2傳代，例如,，24孔板收集5孔,，傳代10孔，需要的基質(zhì)膠量25*10=250ul

密度建議2：500個(gè)細(xì)胞團(tuán)/25uL基質(zhì)膠（如果想計(jì)數(shù)接種,，可以參照此密度建議）

注意：不管是按密度建議1還是,，密度建議2，如果有殘留的基質(zhì)膠,，新膠量至少是殘留膠量的1.5倍

（4）加膠-點(diǎn)板

向細(xì)胞團(tuán)沉淀加入基質(zhì)膠(abs9495),，進(jìn)行吹打混勻（不要滿吹滿打，容易產(chǎn)生氣泡）,，然后進(jìn)行點(diǎn)板,。整個(gè)操作在金屬冰盒或冰上進(jìn)行,。操作熟練以后，加膠,，混勻,，點(diǎn)板控制在半分鐘內(nèi)，有利于保持基質(zhì)膠良好的流暢性,。

（5）加液

將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中40-60min成膠,，添加500-750μl人腸癌類(lèi)器官培養(yǎng)基 A進(jìn)行培養(yǎng)。大概10-14天,，多數(shù)類(lèi)器官直徑在200-300um,，可進(jìn)行傳代操作。

二,、類(lèi)器官數(shù)量不足或體積較小時(shí)：

1,、類(lèi)器官收集、吹打,、洗滌

1）移液器吸去培養(yǎng)基,，每孔添加 1-2ml 左右4℃類(lèi)器官傳代培養(yǎng)緩沖液G，輕柔吹散基質(zhì)膠,。

2）進(jìn)行吹打,，將類(lèi)器官吹成細(xì)胞團(tuán)（可取樣鏡下觀察有較多細(xì)胞團(tuán)時(shí)可停止吹打）；

3）洗滌： 24孔板,，每5孔為一組,，收集在 15ml 離心管中,，加類(lèi)器官傳代培養(yǎng)緩沖液G定容至14ml（緩沖液越多,，基質(zhì)膠被稀釋的越充分，越容易去除）,，4℃靜置 40min或-20℃放置5min（目的是使基質(zhì)膠軟化,，如果冰箱保溫效果強(qiáng)，縮短冷凍時(shí)間,，摸索合適的冷凍時(shí)間時(shí),，可取出離心管搖晃看不到基質(zhì)膠說(shuō)明冷化好了）。

4）接下來(lái)將離心管進(jìn)行300g,，4℃,， 離心5min，離心完通常會(huì)有這兩種情況：

第一種是正常情況,，分成三層（如下圖）,，此時(shí)棄掉上清和基質(zhì)膠層，保留細(xì)胞團(tuán)沉淀即可,。

第二種是不正常情況,，分成兩層（如下圖）,，這種情況可能與冷化不充分有關(guān)。此時(shí)棄掉緩沖液,，留下基質(zhì)膠類(lèi)器官混懸液,，重復(fù)上一步洗滌步驟，再次冷化離心,，通常能出現(xiàn)清晰分層（緩沖液層,、基質(zhì)膠層、類(lèi)器官沉淀層）,，此時(shí)棄掉上清和基質(zhì)膠層,，保留類(lèi)器官沉淀即可。如果依然是兩層（緩沖液層和基質(zhì)膠細(xì)胞團(tuán)混懸液層）,，此時(shí)棄掉緩沖液和上1/3的基質(zhì)膠細(xì)胞團(tuán)混懸液,，保留下2/3即可。

促進(jìn)基質(zhì)膠和類(lèi)器官有效分離條件：

a 離心機(jī)的選擇非常重要,，水平角離心機(jī)相比固定角離心機(jī)更利于基質(zhì)膠和類(lèi)器官分離,；

b 離心機(jī)的溫度最好是4℃（可避免基質(zhì)膠固化），離心轉(zhuǎn)速可適當(dāng)提高（最高不要超過(guò)500g）,，離心時(shí)間可適當(dāng)加長(zhǎng)（最常不超過(guò)10min）,。

2、加膠-點(diǎn)板-加液

（1）準(zhǔn)備工作

a 基質(zhì)膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過(guò)夜融化,；

b 槍頭,、離心管需要-20℃提前預(yù)冷至少半小時(shí)；

c 融化后的基質(zhì)膠可一直放4℃儲(chǔ)存,，建議2周內(nèi)用完,。

（2）接種要求

24孔板(abs7035)，每孔25ul基質(zhì)膠細(xì)胞團(tuán)混合物,，500-750uL類(lèi)器官培養(yǎng)液

（3）接種密度

密度建議1： 對(duì)于類(lèi)器官數(shù)量較少的情況,，為了維持生長(zhǎng)所需的旁分泌信號(hào)，需要2-3孔富集到1孔,，例如,，24孔板收集6孔，2孔富集1孔,，鋪3孔,，需要的基質(zhì)膠量25*3=75uL

密度建議2：500個(gè)細(xì)胞團(tuán)/25uL基質(zhì)膠（如果想計(jì)數(shù)接種，可以參照此密度建議）

注意：不管是按密度建議1還是按密度建議2,，如果有殘留的基質(zhì)膠,，新膠量至少是殘留膠量的1.5倍

（4）加膠-點(diǎn)板

向細(xì)胞團(tuán)沉淀加入基質(zhì)膠(abs9495)，進(jìn)行吹打混勻（不要滿吹滿打,，容易產(chǎn)生氣泡）,，然后進(jìn)行點(diǎn)板,。整個(gè)操作在金屬冰盒或冰上進(jìn)行。操作熟練以后,，加膠,，混勻，點(diǎn)板控制在半分鐘內(nèi),，有利于保持基質(zhì)膠良好的流暢性,。

（5）加液

將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中40-60min成膠，添加500-750μl類(lèi)器官培養(yǎng)基 A進(jìn)行培養(yǎng),。大概7-10天,，多數(shù)類(lèi)器官直徑在200-300um，可進(jìn)行再次傳代,。

凍存

凍存要領(lǐng):

類(lèi)器官不需要消化（消化后的類(lèi)器官?gòu)?fù)蘇活率低）,；

在類(lèi)器官指數(shù)增長(zhǎng)期凍存（等到該傳代的時(shí)候類(lèi)器官活性比指數(shù)期差），也就傳代后的Day3-Day4,，多數(shù)類(lèi)器官直徑在100um-200um,，這個(gè)時(shí)機(jī)選擇凍存。

一,、類(lèi)器官收集及洗滌

1,、收集：移液器吸去培養(yǎng)基，每孔添加 1-2ml 左右4℃類(lèi)器官傳代培養(yǎng)緩沖液G,，輕柔吹散基質(zhì)膠,，收集在 15ml 離心管中(24孔板，每5孔為一組),。

2,、洗滌：加類(lèi)器官傳代培養(yǎng)緩沖液G定容至14ml（緩沖液越多，基質(zhì)膠被稀釋的越充分,，越容易去除）,，4℃靜置 40min或-20℃放置5min（目的是使基質(zhì)膠軟化,，如果冰箱保溫效果強(qiáng),，縮短冷凍時(shí)間，摸索合適的冷凍時(shí)間時(shí),，可取出離心管搖晃看不到基質(zhì)膠說(shuō)明冷化好了）,。

3、接下來(lái)將離心管進(jìn)行300g,，4℃,， 離心5min，離心完通常會(huì)有這兩種情況：

第一種是正常情況,，分成三層（如下圖）,，此時(shí)棄掉上清和基質(zhì)膠層,，保留類(lèi)器官沉淀即可。

第二種是不正常情況,，分成兩層（如下圖）,，這種情況可能與冷化不充分有關(guān)。此時(shí)棄掉緩沖液,，留下基質(zhì)膠類(lèi)器官混懸液,，重復(fù)上一步洗滌步驟，再次冷化離心,，通常能出現(xiàn)清晰分層（緩沖液層,、基質(zhì)膠層、類(lèi)器官沉淀層）,，此時(shí)棄掉上清和基質(zhì)膠層,，保留類(lèi)器官沉淀即可。如果依然是兩層（緩沖液層和基質(zhì)膠類(lèi)器官混懸液層）,，此時(shí)棄掉緩沖液和上1/3的基質(zhì)膠類(lèi)器官混懸液,，保留下2/3即可。

促進(jìn)基質(zhì)膠和類(lèi)器官有效分離條件：

a 離心機(jī)的選擇非常重要,，水平角離心機(jī)相比固定角離心機(jī)更利于基質(zhì)膠和類(lèi)器官分離,；

b 離心機(jī)的溫度最好是4℃（可避免基質(zhì)膠固化），離心轉(zhuǎn)速可適當(dāng)提高（最高不要超過(guò)500g）,，離心時(shí)間可適當(dāng)加長(zhǎng)（最常不超過(guò)10min）,。

二、類(lèi)器官凍存

1,、凍存密度,，以24孔板為例

密度建議1：2孔/mL 凍存液

密度建議2：500個(gè)類(lèi)器官/mL 凍存液（如果想計(jì)數(shù)凍存，可以參照此密度建議）

2,、添加適量類(lèi)器官凍存液 F,，輕柔吹打重懸，建議立即進(jìn)行凍存,。（放置太久,，DMSO對(duì)類(lèi)器官有損傷）

3、梯度凍存：將凍存管放入梯度凍存盒然后保存至-80℃過(guò)夜,，第二天取出放入液氮罐,。

     手動(dòng)凍存：4℃冰箱放置30 min，轉(zhuǎn)移至-20℃放置1h,，然后移至-80℃過(guò)夜,，第二天取出放入液氮罐。

復(fù)蘇

一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

1,、將水浴鍋預(yù)熱至37℃,；

2、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行常規(guī)消毒,，用預(yù)防噴霧噴涂并且使用紫外線照射40min的超凈工作臺(tái)臺(tái)面,；

3、在超凈工作臺(tái)中按次序擺好消過(guò)毒的離心管,、吸管,、培養(yǎng)板等。

二,、取出凍存管

1,、根據(jù)類(lèi)器官凍存記錄按標(biāo)簽找到所需類(lèi)器官的編號(hào)。

2,、從液氮罐中取出凍存盒,，取出所需的凍存管，同時(shí)核對(duì)凍存管外的編號(hào),。

三,、迅速解凍

1、迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中解凍,，并要不斷地?fù)u動(dòng),，使管中地液體迅速融化。

2,、約1-2min后凍存管內(nèi)液體wan全溶解,，取出用酒精棉球擦拭凍存管地外壁，再拿入超凈臺(tái)內(nèi),。

四,、將類(lèi)器官凍存液移入15ml離心管，添加10倍體積類(lèi)器官傳代培養(yǎng)緩沖液 G（緩沖液體積：凍存液體積=10:1）重懸,，輕柔吹打混勻,，300g 4℃ 離心 5min，棄上清,。

五,、加膠-點(diǎn)板-加液

1、準(zhǔn)備工作

（1）基質(zhì)膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過(guò)夜融化

（2）槍頭,、離心管需要-20℃提前預(yù)冷至少半小時(shí)

（3）融化后的基質(zhì)膠可一直放4℃儲(chǔ)存,，建議2周內(nèi)用完

2,、復(fù)蘇要求

24孔板（abs7035）,，每孔25ul基質(zhì)膠類(lèi)器官混合物，500-750uL類(lèi)器官培養(yǎng)液

3、復(fù)蘇密度

復(fù)蘇密度建議1：1:1接種（原來(lái)凍幾孔就復(fù)蘇幾孔）

復(fù)蘇密度建議2：250個(gè)類(lèi)器官/25uL基質(zhì)膠（如果想計(jì)數(shù)接種,，可以參照此密度建議）

4,、加膠-點(diǎn)板

向類(lèi)器官沉淀加入基質(zhì)膠（abs9495），進(jìn)行吹打混勻（不要滿吹滿打,，容易產(chǎn)生氣泡）,，然后進(jìn)行點(diǎn)板。整個(gè)操作在金屬冰盒或冰上進(jìn)行,。操作熟練以后,，加膠，混勻,，點(diǎn)板控制在半分鐘內(nèi),，有利于保持基質(zhì)膠良好的流暢性。

5,、加液

將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中40-60min成膠,，添加500-750μl類(lèi)器官培養(yǎng)基 A進(jìn)行培養(yǎng)。大概10-14天,，多數(shù)類(lèi)器官直徑在200um-500um,，可進(jìn)行傳代操作。

關(guān)鍵注意事項(xiàng)

1,、Matrigel操作：全程冰上操作,，避免提前固化。  

2,、密度控制：內(nèi)胚層分化前細(xì)胞需達(dá)85-90%融合,，否則影響球狀體形成。 

3,、生長(zhǎng)因子活性：使用新鮮配制或分裝保存的因子,，避免反復(fù)凍融。 

4,、污染防控：無(wú)菌操作,，定期檢測(cè)支原體。  

常見(jiàn)問(wèn)題與解決（Troubleshooting）

通過(guò)嚴(yán)格遵循上述步驟并優(yōu)化細(xì)節(jié)，可高效生成功能性人類(lèi)腸道類(lèi)器官,，適用于疾病建模,、藥物篩選等研究。

今天講解就到這了,，大家如有實(shí)驗(yàn)問(wèn)題,，歡迎一起交流哦,！

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