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IPS誘導(dǎo)腸類器官培養(yǎng)分為三大階段：人多能干細(xì)胞的培養(yǎng),、內(nèi)胚層分化及中/后腸模式化誘導(dǎo),、類器官培養(yǎng)。

內(nèi)胚層分化及中/后腸模式化誘導(dǎo)

一,、前期準(zhǔn)備

1,、試劑與設(shè)備

   - 細(xì)胞：H1/H9 hESC或患者來(lái)源iPSCs。  

   - 培養(yǎng)基：人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基(abs9403),、RPMI 1640(abs9484),。

   - 消化液：人多能干細(xì)胞消化液(abs9409)

   - 培養(yǎng)基添加劑：L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液(2mM)(abs9295)、雙抗(abs9244)

   - 生長(zhǎng)因子：Activin A(100ng/mL)(abs05801),、FGF4(500ng/mL)(abs06269),、WNT3a(500ng/mL)(abs05632)。  

   - 基質(zhì)膠：即用型基質(zhì)膠（培養(yǎng)板包被）(abs9410),、類器官專用基質(zhì)膠(abs9495),。

   - 血清：透析胎牛血清(abs945)

   - 關(guān)鍵設(shè)備：表面培養(yǎng)皿、立體顯微鏡,、無(wú)菌手術(shù)刀,、預(yù)冷微量離心管。 

2,、試劑配制

   - 內(nèi)胚層分化培養(yǎng)基：  

     - Day1：RPMI 1640+L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液(2mM)+雙抗(1%)+Activin A(100ng/mL),。  

     - Day2：Day1配方+透析胎牛血清(0.2%)。  

     - Day3：Day1配方+透析胎牛血清(2%),。  

   - 中/后腸分化培養(yǎng)基：

     -RPMI 1640+透析胎牛血清(2%)+FGF4(500ng/mL)+WNT3a(500ng/mL),。

二,、hPSCs傳代與鋪板

1,、細(xì)胞傳代（耗時(shí)2h）  

   - 使用人多能干細(xì)胞消化液消化hPSCs至邊緣卷起。  

   - 用細(xì)胞刮刀輕柔剝離細(xì)胞團(tuán),，反復(fù)吹打至1-2mm大小細(xì)胞團(tuán),。  

   - 按1:6比例接種至Matrigel包被的24孔板（每孔約5000個(gè)細(xì)胞團(tuán)）,。  

   - 輕敲培養(yǎng)板使細(xì)胞均勻分布，37°C過(guò)夜培養(yǎng),。  

2,、細(xì)胞擴(kuò)增至85-90%融合（3-4天）  

   - 每日更換人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞密度,。  

   - 關(guān)鍵：密度過(guò)高（自發(fā)分化）或過(guò)低（分化效率低）需重新鋪板,。

三、內(nèi)胚層分化（3天）

1,、Day1：吸除人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基,，加入Day1內(nèi)胚層培養(yǎng)基（無(wú)血清），培養(yǎng)24h,。  

2,、Day2：更換為Day2內(nèi)胚層培養(yǎng)基（含0.2%透析胎牛血清），培養(yǎng)24h,。  

3,、Day3：更換為Day3內(nèi)胚層培養(yǎng)基（含2%透析胎牛血清），培養(yǎng)24h,。  

4,、驗(yàn)證分化效率（可選）：  

   - 免疫染色檢測(cè)FOXA2/SOX17雙陽(yáng)性細(xì)胞（效率應(yīng)達(dá)85-90%）。

四,、中/后腸模式化（3-4天）

1,、誘導(dǎo)球狀體形成

   -吸除內(nèi)胚層培養(yǎng)基，加入中/后腸分化培養(yǎng)基,，每日更換,。  

   -48h后：立體顯微鏡下觀察上皮增厚，72-96h球狀體(spheroids)脫離單層細(xì)胞,。  

2,、收集球狀體

   -用200μL槍頭收集游離球狀體，每管約50個(gè),，置于冰上備用,。

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