相信大家看著這個(gè)標(biāo)題,，心情都是沉重的,，尤其是對(duì)一些難養(yǎng)的類器官，好不容易養(yǎng)起來(lái)了,，結(jié)果傳完代長(zhǎng)不起來(lái)了,，這是啥情況啊,？今天咱們從下面3個(gè)層面分析類器官傳代失敗原因,。
影響類器官傳代因素
一、類器官傳代手法
影響類器官傳代最主要的因素是傳代手法,。尤其是一些嬌貴的類器官,，就像溫室的花朵，經(jīng)不起任何“風(fēng)雨",，比如基質(zhì)膠冷化條件（溫度及時(shí)長(zhǎng)）,、離心條件（溫度、轉(zhuǎn)速,、時(shí)長(zhǎng)）,、棄除上清時(shí)的類器官丟失、消化條件（溫度,、時(shí)長(zhǎng)）,、吹打力度對(duì)于它們來(lái)說(shuō)就是“西天取經(jīng)路上的九九八十一難"。
（1）基質(zhì)膠冷化溫度,、時(shí)長(zhǎng)
類器官傳代時(shí),，我們需要把5-10孔（24孔板為例）的基質(zhì)膠和類器官混懸物用類器官傳代緩沖液(abs9730)吹散后收集到15mL離心管，并用類器官傳代緩沖液定容到14mL,。接下來(lái)冷化基質(zhì)膠,，可以選擇多種方式比如，4℃預(yù)冷30min,； 0℃預(yù)冷30min；-20℃預(yù)冷5min,。通常情況下,，多數(shù)類器官都是可以采取上述三種方式，但少數(shù)類器官對(duì)溫度或時(shí)長(zhǎng)過(guò)于敏感,。對(duì)溫度過(guò)于敏感的類器官建議采用4℃預(yù)冷30min或0℃預(yù)冷30min,；對(duì)時(shí)長(zhǎng)過(guò)于敏感的類器官建議采用-20℃預(yù)冷5min。
（2）離心溫度,、轉(zhuǎn)速,、時(shí)長(zhǎng)
離心對(duì)類器官可能造成的損傷主要包括：
A,、機(jī)械應(yīng)力損傷：離心過(guò)程中產(chǎn)生的機(jī)械應(yīng)力可能會(huì)對(duì)類器官細(xì)胞造成破壞。這種損傷可能包括細(xì)胞膜的破裂,、細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的損傷,，以及細(xì)胞功能的喪失。
B,、溫度影響：離心時(shí)的溫度對(duì)類器官的保存狀態(tài)有重要影響,。如果離心溫度過(guò)高，可能會(huì)導(dǎo)致基質(zhì)膠固化,，影響類器官的分離和保存,。因此，建議在4°C的低溫條件下進(jìn)行離心,，以避免熱損傷,。
基質(zhì)膠冷化后在進(jìn)行離心分層時(shí)，建議選用水平角離心機(jī),，轉(zhuǎn)速控制200g-300g,，溫度設(shè)為4℃，時(shí)長(zhǎng)控制在5min以內(nèi),。
（3）棄除上清時(shí)的類器官丟失
分層現(xiàn)象（緩沖液,、基質(zhì)膠、類器官沉淀）
離心后的類器官正常是分層三層：緩沖液,、基質(zhì)膠,、類器官沉淀，正常我們是保留類器官沉淀層,，上面的緩沖液和基質(zhì)膠去掉,。但如果我們?cè)囵B(yǎng)的類器官數(shù)量就很少，分層后的類器官沉淀層也會(huì)很少,，這種情況下,，我們不僅要保留類器官沉淀，還要保留基質(zhì)膠的下2/3,，甚至基質(zhì)膠全層,，以減少類器官的遺失（基質(zhì)膠層會(huì)殘留類器官）。點(diǎn)膠時(shí)保證新膠量是殘留膠的1.5倍體積以上,，以保證基質(zhì)膠的貼壁粘附性,。
當(dāng)然，有時(shí)候離心后的類器官離心后也會(huì)出現(xiàn)兩層：緩沖液,、基質(zhì)膠類器官混懸液,。這種情況，建議保留基質(zhì)膠類器官混懸液下2/3,，甚至基質(zhì)膠全層,，以減少類器官的遺失（基質(zhì)膠層會(huì)殘留類器官）,。點(diǎn)膠時(shí)保證新膠量是殘留膠的1.5倍體積以上，以保證基質(zhì)膠的貼壁粘附性,。
（4）消化溫度,、時(shí)長(zhǎng)
上述離心后的類器官懸液在進(jìn)行消化傳代時(shí)，那么要特別注意消化溫度,、時(shí)長(zhǎng)的控制,。消化過(guò)度對(duì)類器官造成的損傷體現(xiàn)在兩個(gè)方面：
A、細(xì)胞膜損傷和細(xì)胞死亡：消化過(guò)強(qiáng)可能會(huì)破壞細(xì)胞膜,，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物釋放到培養(yǎng)基中,，引起細(xì)胞死亡。
B,、細(xì)胞凋亡增加：胰酶消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng),，可能會(huì)增加細(xì)胞的凋亡率。因?yàn)檫^(guò)度的消化可能對(duì)細(xì)胞膜造成損傷,，影響細(xì)胞表面受體蛋白的功能性和完整性,。
雖然消化酶在37℃下活性最好，但消化效力太強(qiáng)對(duì)類器官不一定是好事,，通常我們?cè)谑覝爻瑑襞_(tái)內(nèi)進(jìn)行類器官消化就可以了,，能更好地把控消化程度，及時(shí)根據(jù)鏡檢結(jié)果終止消化進(jìn)程,。同時(shí),，消化時(shí)長(zhǎng)建議2-3min即可（消化時(shí)間越長(zhǎng)，可能會(huì)增加酶對(duì)類器官造成的損傷）,。
（5）吹打力度
槍頭吹打在類器官培養(yǎng)中產(chǎn)生的主要有兩種力：機(jī)械損傷和剪切力,。
A、機(jī)械損傷：這主要是指槍頭刮擦,、細(xì)胞間相互碰撞等導(dǎo)致的細(xì)胞損傷,。為了減少這部分損傷，需要盡量減小吹打力度,，只要保證能夠吹下吹散細(xì)胞就行,。槍頭與細(xì)胞層接觸甚至研磨會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞直接死亡，因此在操作時(shí)需要控制槍頭與培養(yǎng)板底的間距,，避免直接接觸,。
B、剪切力：剪切力是指物體橫截面受到外力影響,，沿外力方向相對(duì)移動(dòng)的現(xiàn)象，這個(gè)外力就叫做剪切力,。 在細(xì)胞培養(yǎng)基里,，如果有很多氣泡,，細(xì)胞處在氣泡與培養(yǎng)基之間，當(dāng)氣泡破碎時(shí),，細(xì)胞瞬間會(huì)受到強(qiáng)大的剪切力影響從而導(dǎo)致細(xì)胞碎裂,。
如果選擇機(jī)械吹打傳代方式，吹打的力度和次數(shù)對(duì)類器官活性影響很大,。如果用1mL槍頭吹打,，操作一定要輕柔，避免液流剪切力多類器官造成割傷,，也可使用無(wú)菌巴適吸管代替槍頭,，對(duì)類器官傷害小。同時(shí)吹打次數(shù)控制在30次以內(nèi),，可隨時(shí)鏡下觀察,，一旦類器官?gòu)幕|(zhì)膠中解離出來(lái)，并且有較多細(xì)胞團(tuán)塊,，即可停止吹打,。因此， 在進(jìn)行類器官吹打時(shí),，需要特別注意控制力度和技巧,，以減少對(duì)細(xì)胞的損傷。
二,、類器官本身
傳代后的肺癌類器官一周內(nèi)基本不長(zhǎng)
（1）類器官活性強(qiáng)度
不同種類的類器官活性差異很大,，活性比較強(qiáng)的類器官有子宮內(nèi)膜癌類器官、腸癌類器官,，培養(yǎng)相對(duì)容易很多,，連續(xù)傳代甚至可達(dá)30多代。然而有些類器官本身活性不足,，比如甲狀腺癌類器官,，只能維持原代，傳代后基本不長(zhǎng),。除此以外,，一致認(rèn)為難養(yǎng)的類器官還有肝癌類器官、前列腺癌類器官,。
（2）類器官數(shù)量
如果在原代培養(yǎng)中類器官數(shù)量稀少,，例如24孔板，每孔點(diǎn)50uL基質(zhì)膠細(xì)胞團(tuán)混懸物,，長(zhǎng)成的類器官數(shù)量低于20個(gè),，通常是類器官數(shù)量較少的情況。此時(shí),，如果傳代操作不當(dāng),，出現(xiàn)類器官大量丟失,，就會(huì)導(dǎo)致傳下里的細(xì)胞團(tuán)密度過(guò)稀，缺少旁分泌信號(hào)調(diào)控,，類器官增殖困難,，出現(xiàn)長(zhǎng)不大現(xiàn)象。因此,，原代類器官數(shù)量多少也直接影響是否能順利傳代,。
三、營(yíng)養(yǎng)體系
（1）培養(yǎng)基
完quan培養(yǎng)基（添加因子）建議分裝儲(chǔ)存于-20℃,，有效期長(zhǎng)達(dá)1年,；保存在4℃，建議2周內(nèi)用完,，超過(guò)1個(gè)月,，因子活性會(huì)逐漸下降。
4℃儲(chǔ)存太久（一個(gè)月以上）會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基的效能下降,，而效能下降又是怎樣影響類器官傳代效果的呢,？
舉個(gè)例子：消化傳代前后使用的是同一瓶培養(yǎng)基，原代養(yǎng)得可以,，傳代不行了,。大家在推斷原因時(shí)可能會(huì)首先排除培養(yǎng)基問(wèn)題，因?yàn)橄瘋鞔昂笫褂玫氖峭黄颗囵B(yǎng)基,，如果是培養(yǎng)基的問(wèn)題,，原代也養(yǎng)不好才對(duì)，而結(jié)果是原代養(yǎng)得好,，傳代不好了,。這里其實(shí)有大家想不到的因素存在。大家都知道類器官通常傳到一定代次會(huì)出現(xiàn)類器官增殖變緩（比如數(shù)量減少和體積縮?。?，就傳不下去了。因?yàn)?/strong>類器官培養(yǎng)的成體干細(xì)胞或腫瘤干細(xì)胞,，在經(jīng)歷多次傳代后,，干性（自我更新和分化能力）都會(huì)逐代降低，最后就傳不下去,。在類器官原代培養(yǎng)中,，腫瘤干或成體干細(xì)胞干性很強(qiáng)，即便使用4℃儲(chǔ)存過(guò)久的培養(yǎng)基,，依然可以增殖起來(lái),。而當(dāng)不斷傳代后，腫瘤干或成體干細(xì)胞干性逐漸下降，對(duì)培養(yǎng)基的因子活性需求就會(huì)提高,，再使用4℃儲(chǔ)存過(guò)久的培養(yǎng)基就會(huì)難把類器官擴(kuò)增起來(lái),。
（2）類器官傳代消化液
消化液對(duì)類器官傳代的影響主要體現(xiàn)在2個(gè)方面：
A、傳代消化液是否恰當(dāng),，不合適的酶會(huì)造成類器官損傷。
B,、傳代消化液建議分裝保存在-20℃,，有效期長(zhǎng)達(dá)1年，保存在4℃下,，建議2周內(nèi)用完,，超過(guò)1個(gè)月，酶活會(huì)逐漸下降,。
首先,，消化酶的消化力度還取決于酶的種類。我們嘗試過(guò)胰酶進(jìn)行類器官消化,，發(fā)現(xiàn)胰酶對(duì)類器官的消化損傷比較大,，不適合作為類器官傳代消化酶。所以,，建議大家使用專用的類器官傳代消化液(abs9520),，其采用的多種溫和消化酶對(duì)類器官消化比較溫和。其次,，消化液如果長(zhǎng)時(shí)間存放于4℃,，酶活會(huì)逐漸降低，消化類器官需要時(shí)間會(huì)想要增加,，而增加消化時(shí)間,，把控時(shí)長(zhǎng)不當(dāng)，容易導(dǎo)致消化過(guò)度,，使類器官活性受損,。
（3）基質(zhì)膠
基質(zhì)膠建議分裝保存在-20℃，有效期長(zhǎng)達(dá)1年,，保存在4℃下,，建議2周內(nèi)用完，超過(guò)1個(gè)月,，基質(zhì)膠的粘附性和因子活性會(huì)逐漸下降,。
基質(zhì)膠的作用有兩個(gè)，其一是起支架作用,，維持類器官的橢球形態(tài),，其二是含有豐富的因子種類，對(duì)類器官的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。當(dāng)基質(zhì)膠存4℃儲(chǔ)存時(shí)間過(guò)久,，基質(zhì)膠的粘附性和因子活性均會(huì)大大降低,，此時(shí)的基質(zhì)膠類器官穹頂結(jié)構(gòu)容易脫離培養(yǎng)板底面而漂浮，同時(shí)也難以維持類器官增殖需求,。
今天講解就到這了,，大家如有實(shí)驗(yàn)問(wèn)題，歡迎一起交流哦,！
類器官培養(yǎng)產(chǎn)品推薦
貨號(hào) | 品名 | 規(guī)格 |
abs9920 | 類器官回收液 | 100mL |
abs9730 | 類器官傳代培養(yǎng)緩沖液 | 250mL/500mL |
abs9520 | 類器官傳代消化液 | 100mL/500mL |
abs9495 | 基質(zhì)膠(低因子,無(wú)酚紅) | 1.5mL×4/1.5mL×8 |
abs9445 | Organotial人腸癌類器官培養(yǎng)試劑盒 | 1kit |
abs9786 | Organotial人肝膽管癌類器官培養(yǎng)試劑盒 | 1kit |
abs50059 | 2D/3D/Organoid ATP Viability Assay Kit | 10mL/100mL |
Absin產(chǎn)品線：
爆款產(chǎn)品：試劑盒(mIHC,、IHC、凋亡,、ELISA,、ChIP、Co-IP,、TR-FRET,、生化檢測(cè)、殘留檢測(cè),、多因子檢測(cè)),；細(xì)胞培養(yǎng)(類器官試劑盒+基質(zhì)膠，胎牛血清+培養(yǎng)添加劑+細(xì)胞因子),、分化試劑盒,；分子(mRNA合成服務(wù)+提取試劑盒)；化合物大包裝,；輔助試劑,、耗材/儀器、定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測(cè))...
特色產(chǎn)品：雞胚提取物CEE,、B27,、N2、霍亂毒素B亞單位CTB,、牛腦垂體提取物BPE,、百日咳毒素PTX、重組人胰島素Insulin,、人源低密度脂蛋白LDL...
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