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相信大家看著這個標題,，心情都是沉重的,，尤其是對一些難養(yǎng)的類器官,，好不容易養(yǎng)起來了，結(jié)果傳完代長不起來了,，這是啥情況?。拷裉煸蹅儚南旅?個層面分析類器官傳代失敗原因。

影響類器官傳代因素

一,、類器官傳代手法

影響類器官傳代最主要的因素是傳代手法,。尤其是一些嬌貴的類器官，就像溫室的花朵,，經(jīng)不起任何“風雨",，比如基質(zhì)膠冷化條件（溫度及時長）、離心條件（溫度,、轉(zhuǎn)速,、時長）、棄除上清時的類器官丟失,、消化條件（溫度,、時長）、吹打力度對于它們來說就是“西天取經(jīng)路上的九九八十一難",。

（1）基質(zhì)膠冷化溫度,、時長

類器官傳代時，我們需要把5-10孔（24孔板為例）的基質(zhì)膠和類器官混懸物用類器官傳代緩沖液(abs9730)吹散后收集到15mL離心管,，并用類器官傳代緩沖液定容到14mL,。接下來冷化基質(zhì)膠，可以選擇多種方式比如,，4℃預冷30min,； 0℃預冷30min；-20℃預冷5min,。通常情況下,，多數(shù)類器官都是可以采取上述三種方式，但少數(shù)類器官對溫度或時長過于敏感,。對溫度過于敏感的類器官建議采用4℃預冷30min或0℃預冷30min,；對時長過于敏感的類器官建議采用-20℃預冷5min。

（2）離心溫度,、轉(zhuǎn)速,、時長

離心對類器官可能造成的損傷主要包括：

A、機械應力損傷：離心過程中產(chǎn)生的機械應力可能會對類器官細胞造成破壞,。這種損傷可能包括細胞膜的破裂,、細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的損傷，以及細胞功能的喪失,。

B,、溫度影響：離心時的溫度對類器官的保存狀態(tài)有重要影響。如果離心溫度過高,，可能會導致基質(zhì)膠固化,，影響類器官的分離和保存,。因此，建議在4°C的低溫條件下進行離心,，以避免熱損傷,。

基質(zhì)膠冷化后在進行離心分層時，建議選用水平角離心機,，轉(zhuǎn)速控制200g-300g,，溫度設(shè)為4℃，時長控制在5min以內(nèi),。

（3）棄除上清時的類器官丟失

分層現(xiàn)象（緩沖液,、基質(zhì)膠、類器官沉淀）

離心后的類器官正常是分層三層：緩沖液,、基質(zhì)膠,、類器官沉淀，正常我們是保留類器官沉淀層,，上面的緩沖液和基質(zhì)膠去掉,。但如果我們原代培養(yǎng)的類器官數(shù)量就很少，分層后的類器官沉淀層也會很少,，這種情況下,，我們不僅要保留類器官沉淀，還要保留基質(zhì)膠的下2/3,，甚至基質(zhì)膠全層,，以減少類器官的遺失（基質(zhì)膠層會殘留類器官）。點膠時保證新膠量是殘留膠的1.5倍體積以上,，以保證基質(zhì)膠的貼壁粘附性,。

當然，有時候離心后的類器官離心后也會出現(xiàn)兩層：緩沖液,、基質(zhì)膠類器官混懸液,。這種情況，建議保留基質(zhì)膠類器官混懸液下2/3,，甚至基質(zhì)膠全層,，以減少類器官的遺失（基質(zhì)膠層會殘留類器官）。點膠時保證新膠量是殘留膠的1.5倍體積以上,，以保證基質(zhì)膠的貼壁粘附性,。

（4）消化溫度、時長

上述離心后的類器官懸液在進行消化傳代時,，那么要特別注意消化溫度,、時長的控制。消化過度對類器官造成的損傷體現(xiàn)在兩個方面：

A,、細胞膜損傷和細胞死亡：消化過強可能會破壞細胞膜,，導致細胞內(nèi)容物釋放到培養(yǎng)基中,，引起細胞死亡,。

B,、細胞凋亡增加：胰酶消化時間過長，可能會增加細胞的凋亡率,。因為過度的消化可能對細胞膜造成損傷,，影響細胞表面受體蛋白的功能性和完整性。

雖然消化酶在37℃下活性最好,，但消化效力太強對類器官不一定是好事,，通常我們在室溫超凈臺內(nèi)進行類器官消化就可以了，能更好地把控消化程度,，及時根據(jù)鏡檢結(jié)果終止消化進程,。同時，消化時長建議2-3min即可（消化時間越長,，可能會增加酶對類器官造成的損傷）,。

（5）吹打力度

槍頭吹打在類器官培養(yǎng)中產(chǎn)生的主要有兩種力：機械損傷和剪切力。

A,、機械損傷：這主要是指槍頭刮擦,、細胞間相互碰撞等導致的細胞損傷。為了減少這部分損傷,，需要盡量減小吹打力度,，只要保證能夠吹下吹散細胞就行。槍頭與細胞層接觸甚至研磨會導致細胞直接死亡,，因此在操作時需要控制槍頭與培養(yǎng)板底的間距,，避免直接接觸。

B,、剪切力：剪切力是指物體橫截面受到外力影響,，沿外力方向相對移動的現(xiàn)象，這個外力就叫做剪切力,。 在細胞培養(yǎng)基里,，如果有很多氣泡，細胞處在氣泡與培養(yǎng)基之間,，當氣泡破碎時,，細胞瞬間會受到強大的剪切力影響從而導致細胞碎裂。

如果選擇機械吹打傳代方式,，吹打的力度和次數(shù)對類器官活性影響很大,。如果用1mL槍頭吹打，操作一定要輕柔,，避免液流剪切力多類器官造成割傷,，也可使用無菌巴適吸管代替槍頭,，對類器官傷害小。同時吹打次數(shù)控制在30次以內(nèi),，可隨時鏡下觀察,，一旦類器官從基質(zhì)膠中解離出來，并且有較多細胞團塊,，即可停止吹打,。因此， 在進行類器官吹打時,，需要特別注意控制力度和技巧,，以減少對細胞的損傷。

二,、類器官本身

傳代后的肺癌類器官一周內(nèi)基本不長

（1）類器官活性強度

不同種類的類器官活性差異很大,，活性比較強的類器官有子宮內(nèi)膜癌類器官、腸癌類器官,，培養(yǎng)相對容易很多,，連續(xù)傳代甚至可達30多代。然而有些類器官本身活性不足,，比如甲狀腺癌類器官,，只能維持原代，傳代后基本不長,。除此以外,，一致認為難養(yǎng)的類器官還有肝癌類器官、前列腺癌類器官,。

（2）類器官數(shù)量

如果在原代培養(yǎng)中類器官數(shù)量稀少,，例如24孔板，每孔點50uL基質(zhì)膠細胞團混懸物,，長成的類器官數(shù)量低于20個,，通常是類器官數(shù)量較少的情況。此時,，如果傳代操作不當,，出現(xiàn)類器官大量丟失，就會導致傳下里的細胞團密度過稀,，缺少旁分泌信號調(diào)控,，類器官增殖困難，出現(xiàn)長不大現(xiàn)象,。因此,，原代類器官數(shù)量多少也直接影響是否能順利傳代。

三,、營養(yǎng)體系

（1）培養(yǎng)基

完quan培養(yǎng)基（添加因子）建議分裝儲存于-20℃,，有效期長達1年,；保存在4℃，建議2周內(nèi)用完,，超過1個月,，因子活性會逐漸下降。

4℃儲存太久（一個月以上）會導致培養(yǎng)基的效能下降,，而效能下降又是怎樣影響類器官傳代效果的呢,？

舉個例子：消化傳代前后使用的是同一瓶培養(yǎng)基,，原代養(yǎng)得可以,，傳代不行了。大家在推斷原因時可能會首先排除培養(yǎng)基問題,，因為消化傳代前后使用的是同一瓶培養(yǎng)基,，如果是培養(yǎng)基的問題，原代也養(yǎng)不好才對,，而結(jié)果是原代養(yǎng)得好,，傳代不好了。這里其實有大家想不到的因素存在,。大家都知道類器官通常傳到一定代次會出現(xiàn)類器官增殖變緩（比如數(shù)量減少和體積縮?。蛡鞑幌氯チ?。因為類器官培養(yǎng)的成體干細胞或腫瘤干細胞,，在經(jīng)歷多次傳代后，干性（自我更新和分化能力）都會逐代降低,，最后就傳不下去,。在類器官原代培養(yǎng)中，腫瘤干或成體干細胞干性很強,，即便使用4℃儲存過久的培養(yǎng)基,，依然可以增殖起來。而當不斷傳代后,，腫瘤干或成體干細胞干性逐漸下降,，對培養(yǎng)基的因子活性需求就會提高，再使用4℃儲存過久的培養(yǎng)基就會難把類器官擴增起來,。

（2）類器官傳代消化液

消化液對類器官傳代的影響主要體現(xiàn)在2個方面：

A,、傳代消化液是否恰當，不合適的酶會造成類器官損傷,。

B,、傳代消化液建議分裝保存在-20℃，有效期長達1年,，保存在4℃下,，建議2周內(nèi)用完,，超過1個月，酶活會逐漸下降,。

首先,，消化酶的消化力度還取決于酶的種類。我們嘗試過胰酶進行類器官消化,，發(fā)現(xiàn)胰酶對類器官的消化損傷比較大,，不適合作為類器官傳代消化酶。所以,，建議大家使用專用的類器官傳代消化液(abs9520),，其采用的多種溫和消化酶對類器官消化比較溫和。其次,，消化液如果長時間存放于4℃,，酶活會逐漸降低，消化類器官需要時間會想要增加,，而增加消化時間,，把控時長不當，容易導致消化過度,，使類器官活性受損,。

（3）基質(zhì)膠

基質(zhì)膠建議分裝保存在-20℃，有效期長達1年,，保存在4℃下,，建議2周內(nèi)用完，超過1個月,，基質(zhì)膠的粘附性和因子活性會逐漸下降,。

基質(zhì)膠的作用有兩個，其一是起支架作用,，維持類器官的橢球形態(tài),，其二是含有豐富的因子種類，對類器官的生長有促進作用,。當基質(zhì)膠存4℃儲存時間過久,，基質(zhì)膠的粘附性和因子活性均會大大降低，此時的基質(zhì)膠類器官穹頂結(jié)構(gòu)容易脫離培養(yǎng)板底面而漂浮,，同時也難以維持類器官增殖需求,。

今天講解就到這了，大家如有實驗問題,，歡迎一起交流哦,！

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