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一、概述

細胞凋亡是一種細胞主動有序的死亡,，它涉及一系列基因的激活,、表達以及調(diào)控等作用，它并不是病理條件下自體損傷的一種現(xiàn)象,，而是為了更好地適應生存環(huán)境而主動爭取的一種死亡,。今天，小愛向大家介紹細胞凋亡六大常用方法：細胞膜磷脂酰絲氨酸檢測,、TUNEL缺口末端標記法,、線粒體膜電位檢測、Caspase凋亡核心分子檢測,、形態(tài)學觀察,、線粒體膜電位轉(zhuǎn)換孔檢測。

細胞凋亡檢測方法大全

二,、檢測方法

1,、細胞膜磷脂酰絲氨酸檢測

基于細胞代謝物進行的檢測方法有Annexin V-FITC/PI檢測法(abs50001)、Annexin V-EGFP/PI檢測法(abs50006),、Annexin V-APC/PI檢測法(abs50009),、Annexin V-PE/7-AAD檢測法(abs50007)、Annexin V-APC/7-AAD檢測法(abs50008),。今天,，小愛給大家著重講一下Annexin V-FITC/PI檢測法。

（1）檢測原理

Annexin V/PI檢測原理

（2）適用樣本：貼壁細胞,、懸浮細胞

（3）設備：流式細胞儀/熒光顯微鏡

（4）優(yōu)勢：Annexin是目前最敏感的指標之一,；定性,、定量

（5）Annexin V細胞凋亡檢測結(jié)果

在熒光顯微鏡下，以Annexin V-FITC＆PI雙染可以鑒別正常細胞,、早期凋亡,、晚期凋亡和壞死細胞。如上圖所示,，a,、b、c為熒光顯微鏡下的凋亡細胞,，其中a,、b分別為Annexin V-FITC和PI單染，c為Annexin V-FITC＆PI雙染,；d為普通光學顯微鏡下的凋亡細胞（紅色箭頭所指為晚期凋亡細胞,，綠色箭頭所指為早期凋亡細胞）。

Annexin V 細胞凋亡流式檢測結(jié)果

客戶使用Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(abs50001)的效果如上圖,，文獻名稱：Serine metabolism antagonizes antiviral innate immunity by preventing ATP6V0d2-mediated YAP lysosomal degradation 期刊：Cell Metabolism影響因子： 27.287

（6）Annexin V細胞凋亡檢測注意事項

A,、建議不用含EDTA的胰酶消化貼壁細胞；

B,、建議在用胰蛋白酶處理前單獨收集培養(yǎng)液中懸浮的細胞,，保存在2%的BSA中；

C,、試劑使用前低速離心,，以免液體積存管蓋和管壁；

D,、Annexin V-FITC和PI是光敏物質(zhì),，在操作時請注意避光。在處理和標記時,，盡可能在暗處進行。在孵育階段,，用鋁箔包裹容器或置于抽屜中,。細胞標記后，在暗室內(nèi)用顯微鏡觀察,；

E,、整個操作過程動作要盡量輕柔，勿用力吹打細胞,，盡量在4℃下操作,，以免影響細胞狀態(tài)；

F,、在細胞洗滌的最后一步,，請盡量將上清棄凈,，以免PBS殘留，有可能會影響實驗結(jié)果,；

G,、為防止熒光衰變，宜在1h內(nèi)進行流式檢測,；

H,、PI 染色時間過長有可能造成檢測的凋亡率偏高，建議首先進行Annexin V-FITC染色,，最短可在上機前5min再加入PI染色,。

（7）Annexin V試劑盒選擇指南

2、TUNEL缺口末端標記法

基于TUNEL缺口進行的檢測方法有TUNEL-Biotin檢測法(abs50022),、TUNEL-488檢測法(abs50047),、TUNEL-594檢測法(abs50058)。今天,，小愛給大家著重講一下TUNEL-488檢測法,。

（1）檢測原理

TUNEL缺口末端標記法檢測原理

基因組DNA雙鏈或單鏈斷裂時會出現(xiàn)產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)的催化作用下,，與488/Cy-dUTP結(jié)合,，從而通過熒光顯微鏡或流式細胞儀直接進行凋亡細胞的檢測。

（2）適用樣本：貼壁細胞,、懸浮細胞,、細胞涂片、石蠟切片,、冰凍切片

（3）設備：流式細胞儀,、光學/共聚焦/熒光顯微鏡，熒光酶標儀等

（4）優(yōu)勢：操作簡單,，定性準確

（5）TUNEL細胞凋亡檢測FAQ

A,、紅色熒光和綠色熒光的試劑盒與生物素標記的試劑盒有何不同？

最大的區(qū)別在于適配的儀器不同,，生物素標記的試劑盒適配光學顯微鏡,，所以在細胞核染色時生物素標記的試劑盒一般適配蘇木素或者甲基綠，熒光素標記的試劑盒一般適配DAPI ,，但是熒光素標記的試劑盒實驗時間,、短操作簡便、結(jié)果易觀察,。

B,、陽性對照和陰性對照的作用？

陽性組對照用來驗證本次實驗操作和試劑盒有無問題，陰性組對照為了排除細胞自身凋亡,、操作過程,、或者染料等原因?qū)е碌姆翘禺愋匀旧?/strong>，也用于調(diào)整拍攝曝光強度,。一般情況下只需一個陽性對照和一個陰性對照,，多個組織也可以設立多個陰性對照。

C,、非特異標記（假陽性）,？

a、細胞或組織的核酸酶或聚合酶活性水平較高（如平滑?。?，DNA被切斷，易導致假陽性,。建議：取出細胞或組織后要立即并充分固定,，阻止這些酶的活性，設置陰性對照有助于判斷,；

b,、內(nèi)源性過氧化物酶影響，建議：對于肝臟,、腎臟等血細胞含量多的組織,，適當延長封閉時間和升高過氧化氫的濃度；

c,、固定液濃度過高或過低,，導致組織中心部分固定效果不佳，而使得中心部細胞自溶,、DNA鏈出現(xiàn)不規(guī)則斷裂,，產(chǎn)生假陽性。建議：推薦使用4%多聚甲醛,；

d,、TdT酶反應時間過長或Tunel反應過程中反應液發(fā)生蒸發(fā)或滲漏，細胞或組織表面不能保持濕潤,。建議：注意控制反應時間,，并確保TdT酶反應液能覆蓋樣品；

e,、石蠟、脂肪,、血液,、體液等都較易與染料結(jié)合，所以組織切片制作時要保持干凈、脫蠟要che底,；

f,、有些試劑或細胞存在自發(fā)熒光，選擇染料時要避開自發(fā)熒光的顏色,。

D,、沒有染上熒光？

a,、固定不充分,。固定液選4%多聚甲醛，現(xiàn)用現(xiàn)配,。不建議使用乙醇,，乙醇固定液對組織的滲透力較弱，影響TUNEL標記效率,；

b,、細胞膜和核膜的通透不充分，TdT酶未能到達核內(nèi),。細胞與冰凍切片,，可用2% Triton X-100溶液通透5-30min，石蠟切片推薦使用蛋白酶K,，37℃通透30min,；不同的細胞和組織所需要的通透時間略有不同，時間太長容易脫片,，適當調(diào)整；

c,、延長標記時間至2h,，并適當增加TdT酶及dUTP的用量；

d,、確定實驗對象細胞有凋亡,。準備一份DNase I處理的陽性對照，驗證TdT酶反應是否正確進行,。

E,、熒光背景高？

a,、支原體污染：可以使用支原體染色檢測試劑盒驗證,；

b、TdT酶反應時間過長,，可以用試劑盒提供的TdT酶稀釋液將TdT酶稀釋2-5倍后再按照說明書操作,，稀釋后的TdT酶僅供當日使用；

c、DAB孵育時間過長,，減少DAB染色時間,；

d、處于高速分裂和增殖狀態(tài)中的細胞,，有時也會出現(xiàn)細胞核中的DNA斷裂,。建議：在非高增殖期取樣檢測；

e,、有些試劑或細胞存在自發(fā)熒光,，選擇染料時要避開自發(fā)熒光的顏色；

f,、Biotin-X-dUTP的非特異性結(jié)合,，在TdT酶反應之后，再用含0.1% Triton X-100和1mg/mL BSA的PBS洗三次,。

F,、標記率低？

a,、乙醇,、甲醇或甲醛（市面上購買的甲醛大多含有甲醇）固定的樣品標記效率較低（因為在固定時染色質(zhì)未能與蛋白質(zhì)交聯(lián)，而在操作中丟失）,，采用推薦的固定液,；

b、固定時間過長,，導致交聯(lián)程度過高,，減少固定時間；

c,、貼壁細胞如果使用藥物誘導凋亡,，會細胞皺縮，貼壁黏附力降低,，導致凋亡細胞容易脫落,。建議：請注意操作輕緩，防止發(fā)生凋亡的細胞在洗滌時被洗去,。后續(xù)整個操作也需要輕緩,。

（6）TUNEL試劑盒選擇指南

TUNEL細胞凋亡試劑盒（綠色熒光）(abs50047)

3、Caspase凋亡核心分子檢測

基于Caspase凋亡核心分子進行的檢測方法有Caspase 1活性檢測法(abs50023),、Caspase 2活性檢測法(abs50024),、Caspase 3/7活性檢測法(abs50025)、Caspase 4活性檢測法(abs50026),、Caspase 6活性檢測法(abs50027),。今天,，小愛給大家著重講一下Caspase 3/7活性檢測法。

（1）檢測原理

Caspase-3活性檢測試劑盒的檢測原理圖

基于Caspase 3/7可以催化底物Ac-DEVD-pNA產(chǎn)生黃色的pNA (p-nitroaniline),，從而可以通過測定吸光度來檢測caspase 3/7的活性。pNA在405nm附近有強吸收,。

（2）適用樣本：貼壁細胞,、懸浮細胞、組織樣品

（3）設備：流式細胞儀,、共聚焦/熒光顯微鏡,，熒光酶標儀等

（4）優(yōu)勢：靈敏度高，特異性強,，與其他已知Caspases無交叉反應

4,、線粒體膜電位檢測

基于線粒體膜電位進行的檢測方法有線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-10)(abs50017)、線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)(abs50016),。

（1）檢測原理

線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-10)檢測原理圖

線粒體跨膜電位(Δψm)的下降,，是細胞凋亡級聯(lián)反應過程中最早發(fā)生的事件，利用染料追蹤測試線粒體膜電位,。

（2）適用樣本：貼壁細胞,、懸浮細胞、純化線粒體

（3）設備：流式細胞儀,、共聚焦/熒光顯微鏡,，熒光酶標儀等

（4）JC-1細胞凋亡檢測結(jié)果

Fluorescence images of JC-1-stained chondrocytes

Flow cytometry results of JC-1-stained chondrocytes

客戶使用線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)(abs50016)的效果如上圖，文獻名稱：Curcumin exerts chondroprotective effects against osteoarthritis by promoting AMPK/PINK1/Parkin-mediated mitophagy 期刊：Biomedicine & Pharmacotherapy  影響因子： 7.18

5,、線粒體膜轉(zhuǎn)換孔檢測

基于線粒體膜轉(zhuǎn)換孔進行的檢測方法有線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)檢測試劑盒(abs50064),。

（1）檢測原理

線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)檢測原理圖

當細胞發(fā)生凋亡時和病理性死亡時，線粒體膜電位轉(zhuǎn)換孔滲透性發(fā)生改變,，Ca²⁺的過載,，線粒體谷胱甘肽的氧化，活性氧水平的升高,，包括后繼細胞色素C的釋放,，線粒體膜電位下降等都會導致線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔的激活。

（2）適用樣本：貼壁細胞,、懸浮細胞

（3）設備：流式細胞儀,、共聚焦/熒光顯微鏡，熒光酶標儀等

（4）染料：Calcein AM

6,、形態(tài)學觀察

基于細胞形態(tài)學觀察進行的檢測方法有熒光顯微鏡/光學顯微鏡觀察法{DAPI染色法(abs47047616),、Hoechest 染色法(abs47047620)、AO染色法(abs9735),、HE染色法(abs9217)},、透射電子顯微鏡觀察法,。

（1）熒光顯微鏡/光學顯微鏡觀察法

A、檢測原理

Emodin induces apoptosis of human cervical cancer hela cells via intrinsic mitochondrial and extrinsic death receptor pathway. Cancer cell international. 13. 71. 10.1186/1475-2867-13-71.

借助相應的染色方法,，直接觀察細胞形態(tài)的改變,。常用熒光染料有Hoechest 33342、吖啶橙(AO),、DAPI等,；化學染料有蘇木精 -伊紅(HE)、姬姆薩(Giemsa)或賴特(Wright)

B,、樣本類型：貼壁細胞,、懸浮細胞、細胞涂片,、石蠟切片,、冰凍切片

C、優(yōu)勢：操作簡單,，成本低

D,、缺點：主觀性較大，定性和定量較差,，極少單獨使用

（2）熒光顯微鏡/光學顯微鏡觀察法

A,、檢測原理

Hydrostatic pressure can induce apoptosis of the skin. Scientific Reports. 10. 10.1038/s41598-020-74695-5.

細胞凋亡發(fā)生時會出現(xiàn)一定的形態(tài)學特征，電鏡下凋亡細胞表現(xiàn)為染色質(zhì)凝集,、核濃縮,、核裂解、胞漿收縮和胞膜具有發(fā)泡現(xiàn)象及凋亡小體出現(xiàn)等,。

B,、樣本類型：貼壁細胞、懸浮細胞,、細胞涂片,、石蠟切片、冰凍切片

C,、優(yōu)勢：經(jīng)典,、可靠，金標準

D,、缺點：成本高,、耗時長，步驟繁瑣,，無法定量,，判定時存在主觀性，一次只能觀察小片區(qū)域,。

今天講解就到這了,，大家如有細胞培養(yǎng)問題,，歡迎一起交流哦！

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