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● 什么是蛋白磷酸化？

蛋白磷酸化是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾(Post-translational modification, PTM),，指的是在蛋白質(zhì)的特定氨基酸殘基上添加磷酸基團(tuán)的過(guò)程,。這一過(guò)程通常由一類(lèi)稱(chēng)為蛋白激酶的酶催化，而去除磷酸基團(tuán)則由磷酸酶催化,。磷酸化主要發(fā)生在絲氨酸(Serine),、蘇氨酸(Threonine)和酪氨酸(Tyrosine)殘基上。

圖1 蛋白磷酸化示意圖

● 常見(jiàn)的蛋白激酶

國(guó)際生物化學(xué)聯(lián)合會(huì)根據(jù)受體氨基酸的特異性,，將蛋白激酶分為以下幾類(lèi)：

1）以蛋白乙醇基作為受體的磷酸轉(zhuǎn)移酶稱(chēng)為蛋白絲氨酸或蘇氨酸激酶,；

2）以苯基為磷酸受體的磷酸轉(zhuǎn)移酶稱(chēng)為蛋白酪氨酸激酶,；

3）以His，Arg或Lys為受體的磷酸轉(zhuǎn)移酶稱(chēng)蛋白His激酶,；

4）以Cys殘基作為受體的磷酸轉(zhuǎn)移酶稱(chēng)蛋白Cys激酶,；

5）以乙酰基作為受體的磷酸轉(zhuǎn)移酶稱(chēng)天冬或谷氨酰胺激酶,。

前兩類(lèi)酶最常見(jiàn),，許多蛋白絲/蘇氨酸或酪氨酸激酶已被純化。

● 研究蛋白磷酸化的意義,？

1）細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和調(diào)控：蛋白磷酸化在細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用,。通過(guò)磷酸化修飾，蛋白質(zhì)能夠被激活或抑制,，從而參與細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路的調(diào)控,，包括細(xì)胞增殖、凋亡,、分化等,。這種修飾方式在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、基因表達(dá)調(diào)控,、細(xì)胞周期調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,；

2）細(xì)胞周期和增殖：蛋白質(zhì)磷酸化在細(xì)胞周期的各個(gè)階段中發(fā)揮重要作用。磷酸化修飾可以調(diào)控細(xì)胞周期蛋白的活性,，控制細(xì)胞的有序分裂和增殖,，維持細(xì)胞的正常功能,；

3）疾病發(fā)生和治療：許多疾病的發(fā)生與蛋白質(zhì)磷酸化的異常有關(guān),。研究蛋白質(zhì)磷酸化的變化可以幫助我們理解疾病的發(fā)病機(jī)制，發(fā)現(xiàn)潛在的治療靶點(diǎn),，并開(kāi)發(fā)新的藥物治療策略,。異常的蛋白磷酸化與許多疾病有關(guān)，特別是癌癥,。例如,，某些致癌基因編碼的蛋白激酶可能會(huì)導(dǎo)致不適當(dāng)?shù)牧姿峄M(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)生和發(fā)展,；

4）藥物開(kāi)發(fā)與篩選：通過(guò)分析蛋白質(zhì)磷酸化的變化,，可以發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點(diǎn)和信號(hào)通路，指導(dǎo)藥物的設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā),。同時(shí),，蛋白質(zhì)磷酸化分析還可以用于藥物篩選，評(píng)估藥物對(duì)特定磷酸化位點(diǎn)的調(diào)控效果,；

5）個(gè)體化醫(yī)學(xué)：蛋白質(zhì)磷酸化分析可以為個(gè)體化醫(yī)學(xué)提供重要的指導(dǎo),。通過(guò)檢測(cè)磷酸化位點(diǎn)的狀態(tài),，可以預(yù)測(cè)患者對(duì)特定治療的響應(yīng)，為臨床治療決策提供依據(jù),；

6）生物標(biāo)志物鑒定：研究人員通過(guò)分析蛋白質(zhì)磷酸化的變化,，發(fā)現(xiàn)了許多與疾病相關(guān)的生物標(biāo)志物。這些生物標(biāo)志物可以用于疾病早期診斷,、預(yù)后評(píng)估和治療監(jiān)測(cè)等,；

7）蛋白質(zhì)功能和穩(wěn)定性：磷酸化作用可以改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象，從而改變其活性和/或穩(wěn)定性,。例如,，磷酸化可以通過(guò)改變酶的活性狀態(tài)來(lái)調(diào)節(jié)酶的活性。另外,，磷酸化還可以通過(guò)改變蛋白質(zhì)的降解速率來(lái)調(diào)控蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性,；

8）蛋白質(zhì)相互作用：磷酸化可以改變蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)與其他蛋白質(zhì)之間的相互作用。例如,，磷酸化可以介導(dǎo)蛋白質(zhì)與配體的結(jié)合,，從而影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活。此外,，磷酸化還可以改變蛋白質(zhì)與其他蛋白質(zhì)之間的親和力或抗體性,，從而影響細(xì)胞中的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)互作。

● 常用的蛋白質(zhì)磷酸化檢測(cè)方法有哪些,？

免疫印跡(Western Blotting)：這是一種常用的蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù),，可用于檢測(cè)蛋白質(zhì)磷酸化水平。關(guān)鍵步驟包括蛋白質(zhì)提取,、蛋白質(zhì)分離和轉(zhuǎn)移,、抗體識(shí)別和信號(hào)檢測(cè)。通過(guò)選擇特異性的磷酸化抗體,，可以準(zhǔn)確檢測(cè)目標(biāo)蛋白的磷酸化水平,。

質(zhì)譜分析法(Mass Spectrometry)：質(zhì)譜分析是一種高靈敏度和高分辨率的蛋白質(zhì)分析技術(shù)，可用于檢測(cè)蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)和定量磷酸化水平,。常用的方法包括液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)和磷酸化肽富集等,。通過(guò)分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)，可以鑒定和定量磷酸化肽,，并確定磷酸化位點(diǎn),。

酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)：可以利用磷酸化特異性抗體對(duì)蛋白質(zhì)樣本中的磷酸化水平進(jìn)行定量分析。這種微孔板形式的分析一般是利用目的蛋白特異的捕獲抗體,，和磷酸化狀態(tài)無(wú)關(guān),。隨后讓目的蛋白結(jié)合在抗體包被的分析板中，加入待分析的磷酸化位點(diǎn)特異的檢測(cè)抗體,。

放射性同位素標(biāo)記法：通過(guò)使用32P同位素放射性標(biāo)記磷酸鹽作為磷酸基團(tuán)供體,，經(jīng)過(guò)磷酸化酶促反應(yīng),，帶有32P同位素放射性標(biāo)記的磷酸基團(tuán)則轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的反應(yīng)蛋白上，通過(guò)凝膠電泳分離,，可以用放射自顯影或磷儲(chǔ)屏檢測(cè)磷酸化蛋白質(zhì),。

免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)等也是蛋白質(zhì)磷酸化研究的工具。除此以外,，今天給大家介紹蛋白質(zhì)磷酸化檢測(cè)的新技術(shù)——Phos-iso SDS-PAGE

● 什么是Phos-iso SDS-PAGE,？

這是一種磷酸親和電泳技術(shù)，可使用常規(guī)SDS-PAGE程序分離磷酸化和非磷酸化蛋白質(zhì),。該技術(shù)的核心成分Phos-iso Acrylamide是一種能與磷酸基團(tuán)特異性結(jié)合的雙核金屬絡(luò)合物,，能夠?qū)α姿峄鞍走M(jìn)行分離和檢測(cè)。使用過(guò)程 中只需在常規(guī)SDS-PAGE凝膠中添加Phos-iso Acrylamide和金屬離子（Mn2+或Zn2+）即可,。在電泳時(shí),，固定在凝膠上的Phos-iso復(fù)合物可以特異性結(jié)合磷酸化蛋白，使得磷酸化蛋白電泳遷移率降低,，從而實(shí)現(xiàn)磷酸化和非磷酸化蛋白的分離,。Phos-iso SDS-PAGE操作簡(jiǎn)單，能檢測(cè)不同形式的磷酸化蛋白,，不受磷酸化抗體限制,，可用于免疫印跡、質(zhì)譜分析等,。

圖2 Phos-iso Acrylamide與常規(guī)SDS-PAGE的對(duì)比示意圖

● Phos-iso SDS-PAGE技術(shù)優(yōu)勢(shì)

1）不需要準(zhǔn)備針對(duì)磷酸化蛋白的抗體,，用總抗體而非抗磷酸化蛋白的抗體即可同時(shí)檢測(cè)磷酸化和非磷酸化的蛋白；

2）可適用于免疫印跡和質(zhì)譜分析等后續(xù)操作,；

3）磷酸化位點(diǎn)具有不同數(shù)目和位置的磷酸化形式也可以分離,。

● 愛(ài)必信新品速遞——Glass gel 磷酸化蛋白預(yù)制膠

Glass gel磷酸化蛋白預(yù)制膠（搭配abs9941磷酸化蛋白上樣緩沖液(3×)），預(yù)先加入了100μmol/L的Phos-iso Acrylamide,，打開(kāi)包裝即可直接使用,。預(yù)制膠中含有鋅作為金屬離子,，在中心凝膠緩沖液中保存穩(wěn)定性很好,，得到的帶條結(jié)果也很整齊。分離后,，膠可用于考馬斯亮藍(lán)染色,，免疫印跡和質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)。

1）采用自動(dòng)化的灌膠生產(chǎn)技術(shù),，確保了產(chǎn)品質(zhì)量的高穩(wěn)定性和重復(fù)性,；

2）采用玻璃膠板，有效減少蛋白非特異性吸附,，使蛋白條帶更為敏銳,，清晰,；

3）膠夾打開(kāi)極為輕松，只需用刀片在膠夾一側(cè)輕輕劃一下即可打開(kāi),；

4）兼容市場(chǎng)上主流的mini電泳槽,，如Bio-Rad、Invitrogen,、天能和君意東方等,。

圖3 磷酸化蛋白電泳實(shí)例圖

● 常見(jiàn)問(wèn)題解答

1、條帶彎曲

1）樣品中含無(wú)機(jī)鹽,、表面活性劑,、EDTA和釩酸等（可使用TCA沉淀或透析脫鹽等處理樣品）；

2）樣品處理不當(dāng),，如樣品呈粘性酸性等（變性充分,，酸性樣品溶液呈現(xiàn)黃色-橙色，加入Tris緩沖液中和至藍(lán)紫色即可）,；

3）預(yù)染Marker條帶因含有螯合劑等彎曲導(dǎo)致相鄰條帶彎曲,，空白泳道也會(huì)導(dǎo)致條帶彎曲（樣品與Marker之間使用上樣緩沖液間隔）；

4）電泳溫度高,。

2,、無(wú)法辨別磷酸化條帶

 進(jìn)行常規(guī)SDS-PAGE，驗(yàn)證沒(méi)有發(fā)生條帶遷移,。

3,、如果有對(duì)應(yīng)的磷酸化抗體，磷酸化抗體與Phos-iso SDS-PAGE如何選擇,？

如果使用磷酸化抗體,，需要壓完磷酸化抗體后，將抗體從膜上剝離(strip)后再壓一次總蛋白抗體,。如果使用Phos-iso SDS-PAGE,，就能在同一塊膜上標(biāo)記出磷酸化（或幾種不同磷酸化形式）與非磷酸化的條帶，并可以根據(jù)條帶灰度比較兩者的量,。

4,、樣品必須是純化的蛋白嗎？

不一定,，細(xì)胞裂解液也可以,。純化的樣品進(jìn)行Phos-iso SDS-PAGE即可進(jìn)行檢測(cè)。細(xì)胞裂解液,，則需要進(jìn)行Western Blotting,。

● 注意事項(xiàng)

1）請(qǐng)勿置于0℃以下。凝膠在0℃以下會(huì)凍凝，產(chǎn)生氣泡和裂紋,，導(dǎo)致凝膠報(bào)廢,；

2）需要進(jìn)行樣品前處理，并且樣品品質(zhì)很大程度影響電泳效果,；

3）電泳速度會(huì)變慢,；

4）無(wú)法通過(guò)分子量marker推斷分子量；

5）轉(zhuǎn)膜需要EDTA處理,；

6）普通SDS-PAGE也同時(shí)進(jìn)行,；

7）磷酸化蛋白預(yù)制膠SDS-PAGE對(duì)于蛋白樣品中的雜質(zhì)非常敏感，尤其是螯合劑,、釩酸,、無(wú)機(jī)、表面活性劑這類(lèi)物質(zhì),。強(qiáng)烈建議在磷酸化蛋白預(yù)制膠SDS-PAGE之前通過(guò)TCA沉淀或滲析法降低雜質(zhì)含量,；

8）為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作,。

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