小伙伴們在上篇學習了ELISA實驗的原理,、類型,，并且根據(jù)自己的需求選擇了適合自己的試劑盒，那接下來就是ELISA的實操了,，包括哪些實驗步驟和注意事項呢,？快來和小愛一探究竟吧！
ELISA實驗步驟
圖1 ELISA標準實驗流程
1,、樣本采集：
a）血漿：采集血漿時可使用EDTA,、肝素或檸檬酸鹽作為抗凝血劑。采集后30min內,，1000xg離心15min,。立即檢測或分裝后于≤-20℃儲存。避免反復凍融,。
b）細胞培養(yǎng)上清液：通過離心去除顆粒,，立即檢測或分裝后將樣品于≤-20°C儲存。避免反復凍融,。
c）細胞裂解液：在裂解緩沖液中裂解細胞并將其放在冰上靜置30min,。14,000xg離心5min除去不溶物。將上清液轉移至新管中利用總蛋白分析法定量總蛋白濃度,。立即檢測或分裝后將樣品于≤-20°C儲存,。
d）乏血小板血漿：在采集血漿時可使用EDTA、肝素或檸檬酸鹽作為抗凝血劑,。采集后30min內,，1000xg離心15min。建議在2-8°C下,，10,000xg再次離心10min,，以便去除血小板。立即檢測或分裝后于≤-20°C儲存,。避免反復凍融,。
e）血清：使用不含抗凝劑的收集管,，讓樣品在室溫下凝結30min，然后1000xg離心15min,。立即取出血清并進行檢測或分裝后于≤-20°C儲存,。避免反復凍融。
f）唾液：將唾液收集到管中,，10,00xg離心5min,。收集水相，立即檢測或分裝后將樣品于≤-20°C儲存,。避免反復凍融,。
g）尿液：無菌進行當天shou次尿液的采集(中段尿)，直接排入無菌容器中,。離心去除不溶顆粒物質,。立即檢測或分裝后于≤-20°C儲存。避免反復凍融,。
h）母乳：2-8°C,，1000xg離心15min。重復進行水相部分的收集,，總共3次,。立即檢測。
i）組織勻漿液：制備方法因組織類型而異,。用1XPBS緩沖液沖洗以除去多余血液,，使用20mL 1XPBS進行勻漿，并于≤-20°C下儲存過夜,。將勻漿液凍融兩次以便破壞細胞膜,，然后5000xg離心5min。去除上清液后立即進行檢測,，或者分裝后于≤-20°C儲存,。避免反復凍融。
j）組織裂解液：用PBS沖洗組織,，將組織切成1-2mm的薄片,，用組織勻漿器在PBS中進行勻漿。加入等體積的含蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液,，在室溫下裂解組織30min,，裂解過程中輕搖裂解液,。離心去除沉淀,。利用總蛋白質分析法定量總蛋白的濃度。立即檢測或分裝后于≤-20°C儲存,。
2,、預實驗
ELISA實驗中進行預實驗是非常有必要的,，一方面為了檢測試劑盒是否好用，標曲擬合線性是否良好,，最高OD值是否能達到2.0左右,，是否存在假陽性假陰性；另外一方面為了檢測樣本最佳稀釋比例,，樣本濃度過高要進行稀釋,；樣本濃度過低要選擇超敏試劑盒。
3,、ELISA實驗對照
1）空白對照：提供背景信號參考,，并確保讀取值表示樣品中的分析物濃度。
2）陽性對照：已知含有目標蛋白的內源性可溶樣品,，或已知含有檢測抗體免疫原的純化蛋白或多肽來作為陽性對照,。當樣品的檢測結果為陰性時，陽性對照的陽性結果可表明實驗過程無誤且有效,，所以實驗的陰性結果是真實的,。
3）陰性對照：已知不表達目標蛋白的樣品。其有助于檢測非特異性結合和假陽性結果,。
4）標準品：含有已知濃度的目標蛋白的樣品,，可從中獲得標準曲線。
5）樣本基質中的標準品（加標對照品）：加標對照可用來給出有關某種特殊樣品基質中分析物發(fā)現(xiàn)程度的信息,，從而表明檢測性能,。比如，在ELISA 中檢測血清樣品時,，按照慣例標準品用正常稀釋緩沖液來稀釋,。但可以同時用檢測的種屬血清來稀釋標準品。
4,、實驗步驟（以Human IL-6 ELISA Kit – Absin,，abs510003）
1）準備好所有需要的試劑和標準品；
2）從已平衡至室溫的密封袋中取出微孔,，未用的板條請放回鋁箔袋內,，重新封口；
3）向微孔板中加入300uL洗滌液,，靜置浸泡30s,，棄掉洗液在吸水紙上將微孔板拍干，請立即使用不要讓微孔板干燥,；
4）分別將不同濃度標準品,，實驗樣本或者質控品加入相應孔中，每孔100uL,。用封板膠紙封住反應孔,，室溫孵育2h;
5）將板內液體吸去,，使用洗瓶、多通道洗板器或自動洗板機洗板,。每孔加洗滌液300uL,，然后將板內洗滌液吸去。重復操作3次,。每次洗板盡量吸去殘留液體會有助于得到好的實驗結果,。最后一次洗板結束，請將板內所有液體吸干或將板倒置,，在吸水紙拍干所有殘留液體,；
6）在每個微孔內加入100uL檢測抗體。用封板膠紙封住反應孔,，室溫孵育2h,；
7）重復第5步洗板操作；
8）在每個微孔內加入100uL SA-HRP,，室溫孵育20min,。注意避光；
9）重復第5步洗板操作,；
10）在每個微孔內加入100uL顯色液,，室溫孵育5-30min，注意避光,；
11）在每個微孔內加入50uL終止液,，孔內溶液顏色會從藍色變?yōu)辄S色。如果溶液顏色變?yōu)榫G色或者顏色變化不一致,，請輕拍微孔板,，使溶液混合均勻；
12）加入終止液后30min內,，使用酶標儀測量450nm的吸光度值,，設定570nm或630nm作為校正波長。如果沒有使用雙波長校正,，結果準確度可能會受影響,；
13）計算結果：將每個標準品和樣品的校正吸光度值（OD450-OD540或OD570）、復孔讀數(shù)取平均值,，然后減去平均零標準品OD值,。使用計算機軟件作四參數(shù)邏輯(4-PL)曲線擬合創(chuàng)建標準曲線。另一種方法是,，可以通過繪制標準品濃度做對數(shù)與相應OD值對數(shù)生成曲線,，并通過回歸分析確定最佳擬合線。這個過程可生成一個足夠使用但不太精確的數(shù)據(jù)擬合,。若樣本經過稀釋,，計算濃度時應乘以稀釋倍數(shù)。
ELISA操作小技巧
圖2 ELISA操作小技巧
ELISA常見問題
常見問題 | 原因 | 解決方法 |
無信號或信號低,，但標準曲線正常 | 樣本中無目標分子或目標分子濃度低于試劑盒檢測范圍 | 更換可以檢測濃度更低的試劑盒或對樣本進行濃縮 |
樣本中的基質效應干擾了目標蛋白與抗體結合 | 用適當?shù)南♂屢簩颖具M行濃縮梯度處理,，檢測稀釋的線性度是否良好，設置加標對照品 | |
標準品和樣品都無信號或信號低 | 標準品問題,；標準品毀壞(樣品孔有信號),；標準品重溶方法是否正確 | 重新使用一瓶新的標準品，待標準品恢復室溫后,，按照說明書加入提及的稀釋液,，充分溶解15min |
顯色試劑是否有效；顯色時間不充足 | 進行color test,；增加顯色時間 | |
實驗條件與操作問題 | 孵育溫度,，時間，是否需要振蕩器,，酶標儀是否設置正確等 | |
信號強 | 樣本中檢測分子的濃度高,，超出試劑盒檢測范圍 | 對樣本進行適當?shù)南♂?/span> |
洗滌不充分，殘留有未結合的過氧化物酶 | 按照說明書進行充分洗滌(洗板機,，增加洗滌次數(shù)) | |
板孔有干掉的情況 | 洗滌和加樣的過程中速度要快一些 | |
顯色液,、終止液未及時使用 | 顯色液、終止液盡量現(xiàn)配現(xiàn)用 | |
CV值高或者重復性差 | 洗板不規(guī)范導致washing buffer殘留,，使后加的反應試劑濃度不穩(wěn)定 | 洗滌步驟嚴格按照說明書操作 |
顯色試劑不穩(wěn)定,，各板孔的抗體不穩(wěn)定，不均一 | 盡量選擇質量有保障的試劑盒 | |
實驗溫度問題 | 保持溫度適當且無明顯變化 | |
實驗操作問題 | 嚴格要求操作細節(jié) |
Absin產品線：
爆款產品：試劑盒(mIHC,、IHC,、凋亡、ELISA,、ChIP,、Co-IP、TR-FRET,、生化檢測,、殘留檢測、多因子檢測),；細胞培養(yǎng)(類器官試劑盒+基質膠,，胎牛血清+培養(yǎng)添加劑+細胞因子)、分化試劑盒,；分子(mRNA合成服務+提取試劑盒),；化合物大包裝；輔助試劑,、耗材/儀器,、定制服務(抗體/多肽/蛋白/標記/檢測)...
特色產品：雞胚提取物CEE,、B27、N2,、霍亂毒素B亞單位CTB,、牛腦垂體提取物BPE、百日咳毒素PTX,、重組人胰島素Insulin,、人源低密度脂蛋白LDL...
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