作為常見實驗技能之一的ELISA已經成功逼瘋了一大批研究生：加樣加到手抽筋，拍板拍到人發(fā)瘋,。為此,，小愛嘔心瀝血寫了一份ELISA實驗詳解，原理,、步驟,、注意事項一網打盡，幫助各位小伙伴快速入門并精通ELISA（分為上下兩篇噢）,。
ELISA實驗原理
酶聯(lián)免疫吸附試驗 (Enzyme-linked Immunosorbent Assay,，簡稱ELISA)， 是一種利用抗原抗體結合專一性進行免疫反應的定性和定量檢測方法,，是免疫學經典實驗方法,。ELISA可適用多種樣本類型，主要包括血清,、血漿,、細胞培養(yǎng)物上清液,、細胞裂解物,、唾液、組織裂解物和尿液等,。
實驗名稱 | WB | IHC/IF | ELISA |
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定性 | √ | √ | √ |
定量 | 半定量 | 半定量 | √ |
定位 |
| √ |
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靈敏度 | 中 | 中高 | 高 |
樣本類型 | 組織 | 組織 | 血清 |
表1 ELISA與常規(guī)免疫實驗對比
ELISA實驗類型
1）直接法ELISA：將抗原固定在微孔板上,，使用酶標抗體孵育抗原，最后加入酶反應的底物進行顯色反應,，顯色產生信號與所結合的分析物量成正比,；
2）間接法ELISA：將抗原直接固定在微孔板上，首先將不帶有標記的一抗加入微孔板,，與板內抗原特異性結合,，接著加入酶標二抗識別一抗，最后加入酶反應的底物進行顯色,，顯色信號值與所結合的分析物量成正比,；
3）夾心法ELISA：最常見的ELISA類型。兩種特異性抗體將抗原夾在中間,，通常稱為配對的抗體對,。將捕獲抗體包被在微孔板上，加入樣品后，捕獲抗體與樣本結合,，然后再加入酶標記的檢測抗體,，形成夾心抗體對，最后加入酶反應的底物進行顯色反應,，顯色產生信號值與所結合的分析物量成正比,。夾心法ELISA使用兩種抗體與抗原結合，因此特異性更高,；
4）競爭法：將捕獲抗體包被在微孔板上,，加入標記的抗原，該抗原可與樣本中的目標抗原競爭性結合捕獲抗體,，樣品中存在的抗原越多,，能夠與捕獲抗體結合的標記抗原就越少，加入底物并產生信號,，信號值與樣品中存在的蛋白量成反比,。
ELISA類型 | 優(yōu)點 | 缺點 | 適用場景 |
直接法ELISA | 操作簡單，實驗耗時短 | a)僅使用一種抗體,，所以特異性不夠高 b)如果來自樣本的所有蛋白質都被固定在孔中,，則有可能出現(xiàn)高背景 | 評估抗體的親和力和特異性及研究阻斷/抑制相互作用 |
間接法ELISA | 利用二抗進行信號放大 | 二抗可能引起交叉反應 | 測定內源性抗體 |
夾心法ELISA | a)高特異性和高靈敏度 b)與復雜的樣品基質兼容 | a)實驗流程較長 b)配對抗體對的開發(fā)具有挑戰(zhàn)性 | 確定生物樣本中的分析物濃度 |
競爭法ELISA | 能夠定量小分子 | a)僅使用一種抗體，特異性不高 b)需要標記抗原 | 確定小分子和激素的濃度 |
表2 四種ELISA類型的比較
如何選擇合適的ELISA試劑盒
小伙伴們在了解了ELISA的原理和類型之后,，是不是迫不及待要開始大展身手了,，NO！最重要的ELISA試劑盒,，我們還沒好好選一選呢,。俗話說，兵馬未動,，糧草先行,，選擇一個有質量有保障并且適合自己實驗的ELISA試劑盒，才能夠保證后續(xù)實驗的順利進行,。ELISA試劑盒的選擇和抗體的選擇一樣,，我們都要考慮很多因素，包括以下方面：
1）樣本種屬：一般情況,，不同種屬不能通用,。小鼠、人或者其他家禽的因子檢測要選擇對應種屬的試劑盒,。
2）待測因子表達水平：待測因子表達水平決定著我們要選擇的試劑盒的檢測限和靈敏度,。
3）樣本類型：ELISA實驗可以檢測的樣本類型包括：血清、血漿,、細胞培養(yǎng)上清,、尿液等，不同的試劑盒適配的樣本類型不同。并且不同的樣本,，預處理也會有所不同,。
4）文獻支持：相同的種屬，指標,、靈敏度,，當然會選擇發(fā)表高分文獻多的那一個啦。
5） 試劑盒類型：ELISA的試劑盒有即用型和研發(fā)型兩種,，即用型里面包括實驗所需的所有試劑,，適合新手；研發(fā)型試劑盒需要自己包被微孔板,，勝在經濟實惠,，適合ELISA已經做得爐火純青的熟手。
6）儀器設備：ELISA 檢測方法有很多,，但在實驗室中較普遍的方法是比色,、熒光和化學發(fā)光法，其中比色法又是最常見的,，每個孔中的顯色量用分光光度計讀取,，樣品在彼此之間進行比較，或與用已知分析物濃度制成的標準曲線進行比較,。也就是說,，ELISA的實驗結果需要用酶標儀在對應的波長下檢測吸光度，一般也會使用雙波長測定（檢測波長和校正波長）,，所以酶標儀需要能夠設置到我們使用的兩個波長,。
小愛在這里也給大家推薦兩個品牌的ELISA試劑盒，bio-techne旗下的R&D systems作為ELISA的金標準,，一直致力于開發(fā)包括細胞因子,、ELISA試劑盒,、抗體,、Luminex液相芯片、多因子檢測固相芯片在內的免疫學和細胞生物學產品,，可提供即用型和研發(fā)型兩種ELISA試劑盒,。Absin，中國人自己的生命科學百寶箱,，也能夠提供即用型的ELISA試劑盒,，包含一整套完整的試劑，國產的價格,，進口的品質,。
文中相關產品：
產品名稱 | 貨號 | 檢測范圍 |
Human IL-6 ELISA Kit | abs510003-96T | 9.38pg/mL-600pg/mL |
Human IL-6 ELISA Kit (Plus) | abs551103-96T | 1.56-100pg/ml |
Human IL-6 High Sensitivity ELISA Kit | abs551804-96T | 0.31-20 pg/mL |
Absin產品線：
爆款產品：試劑盒(mIHC、IHC、凋亡,、ELISA,、ChIP、Co-IP,、TR-FRET,、生化檢測、殘留檢測,、多因子檢測),；細胞培養(yǎng)(類器官試劑盒+基質膠，胎牛血清+培養(yǎng)添加劑+細胞因子),、分化試劑盒,；分子(mRNA合成服務+提取試劑盒)；化合物大包裝,；輔助試劑,、耗材/儀器、定制服務(抗體/多肽/蛋白/標記/檢測)...
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