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在之前的文章中,，小愛為大家介紹了IHC的原理以及樣本處理的實驗要點：答應(yīng)我,，看完再做IHC（上）今天我們繼續(xù)看看接下來的實驗流程及操作要點,。首先還是先來回顧一下IHC的整體流程：

前期樣品處理的過程包括載玻片的制備，脫蠟/復(fù)水,，抗原修復(fù)（上期內(nèi)容）,，然后我們需要做樣品的封閉，孵育一抗和二抗,，以及底物檢測，最后的處理步驟包括脫水,，封片和觀察,。PART1我們介紹了樣品制備環(huán)節(jié)，今天我們繼續(xù)看下PART2抗體孵育及檢測,。

PART2 抗體孵育及檢測

（1）淬滅：如果使用基于酶或者生物素的檢測系統(tǒng),，樣本中內(nèi)源性酶的活性（過氧化物酶/堿性磷酸酶）或者內(nèi)源性生物素會對檢測產(chǎn)生非特異性干擾，因此在血清封閉之前需要先對樣品進(jìn)行淬滅,。根據(jù)使用的二抗偶聯(lián)標(biāo)記不同,，使用對應(yīng)的內(nèi)源性封閉液進(jìn)行淬滅,。

小技巧：使用免疫組化筆在樣本周圍畫圈建立疏水隔離區(qū)，可以避免樣品間的交叉染色和節(jié)約血清和抗體的用量,。
 

操作步驟：將組織切片畫上阻水圈,，每切片加100μL（用量以浸沒樣本區(qū)域為準(zhǔn)，可靈活調(diào)節(jié)） 3% H2O2,，室溫下孵育10min,，PBST浸洗3min×3次。

（2）封閉：使用血清對樣品中非特異性結(jié)合位點進(jìn)行封閉,。一般建議在TBST/PBST中加入5%的山羊血清作為封閉液,。

需要注意如果使用酪蛋白封閉液（例如牛奶），可能會影響磷酸化抗體的識別,。

操作步驟：每張切片加100μL（用量以浸沒樣本區(qū)域為準(zhǔn),，可靈活調(diào)節(jié)）5%山羊血清封閉液，室溫孵育30min,。

（3）孵育一抗：抗體孵育可以選擇直標(biāo)一抗的方式或者無標(biāo)記的一抗再偶聯(lián)HRP標(biāo)記的二抗,。間接檢測的方式可以進(jìn)行信號放大，靈敏度更高,，是更為常規(guī)的檢測方式,。一抗用于與樣品中的靶標(biāo)抗原進(jìn)行特異性結(jié)合。

在選擇IHC一抗的時候應(yīng)注意以下幾點：

1,、一抗的反應(yīng)種屬：一抗的反應(yīng)種屬應(yīng)與樣品的種屬一致,，并且一抗的宿主來源不同于樣品種屬。例如：如果樣品是小鼠的腫瘤,，應(yīng)選擇針對于小鼠的抗體,；

2、一抗的特異性：抗體的特異性不好,，容易引起非特異性染色,，單克隆抗體的特異性優(yōu)于多克隆抗體。標(biāo)記mAb的一般是指單克隆抗體,；

3,、查看抗體說明：查看抗體說明書上面的應(yīng)用，注意有些抗體僅適用于IHC-P而不適用于IHC-F,，根據(jù)樣本類型進(jìn)行選擇,；例如下面這個抗體可以適用于IHC-P。

操作步驟：在樣品處加入稀釋后的目的蛋白抗體,，置入4℃冰箱內(nèi)過夜,，PBST浸洗3min×3次。

（4）孵育二抗：二抗與一抗結(jié)合,，并帶有偶聯(lián)標(biāo)記,。

在選擇IHC二抗的時候應(yīng)注意以下幾點：

a. 二抗的反應(yīng)種屬應(yīng)與一抗的宿主來源相同,；

b. 多標(biāo)IHC/IF實驗中，建議優(yōu)先選擇經(jīng)過預(yù)吸附處理的二抗,，可以避免不同物種間抗體的交叉反應(yīng),；

c. 某些細(xì)胞和組織（巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞,、自然殺傷細(xì)胞,，淋巴結(jié)組織，脾臟組織等）表面內(nèi)源性的Fc端受體過多,，建議使用F(ab')?形式的二抗以避免其與樣品Fc受體非特異性結(jié)合,。

操作步驟：在樣品上添加對應(yīng)的二抗，室溫孵育1h,，PBST浸洗3min×3次,。

（5）底物檢測：IHC通過酶和底物反應(yīng)在抗體結(jié)合處顯色以檢測抗原表達(dá)。顯色檢測中需要根據(jù)抗體上的偶聯(lián)標(biāo)記來選擇對應(yīng)的底物,，常見的偶聯(lián)標(biāo)記有HRP和AP,。二抗上帶有HRP標(biāo)記時，一般選擇DAB作為底物進(jìn)行檢測,。

操作步驟：配制即用型DAB工作液,，滴加新鮮配制的DAB工作液到切片上，wan全覆蓋標(biāo)本,。通常顯色1-10min,，DAB顯色時間需要鏡下控制，選擇最佳顯色時間,，做好防護(hù),。自來水沖洗終止DAB顯色反應(yīng)。

（6）蘇木素復(fù)染：蘇木素經(jīng)氧化后生成蘇木精,，是一種堿性染料,，組織學(xué)中用于細(xì)胞核的染色，染色后的細(xì)胞核呈鮮明的藍(lán)色或藍(lán)紫色,，可以更方便的查看細(xì)胞形態(tài),。

操作步驟：滴加適量蘇木素以覆蓋整個組織，復(fù)染 30sec~3min,。用自來水wan全沖洗掉復(fù)染液,。酸酒精（在100ml 70%乙醇中加入1ml鹽酸）分化3-5sec后水洗30sec，終止反應(yīng),。去離子水沖洗切片 3~5min，使胞核返藍(lán),。

明星產(chǎn)品：免疫組化二抗試劑盒（abs957）

二抗檢測試劑盒用于IHC實驗,，包含經(jīng)過條件摸索和實驗驗證的最佳搭配試劑和實驗方案,，試劑盒中包含淬滅劑，封閉液,，一抗放大劑,，酶標(biāo)二抗聚合物和顯色底物。由于IHC實驗一般信號較弱,，需要信號放大,，建議使用二抗檢測試劑盒。

1,、減少一抗用量,，一抗可再稀釋2-4倍；

2,、Polymer酶標(biāo)二抗檢測系統(tǒng),，更低背景；

3,、快速便捷,，更短孵育時間，鼠兔通用,；

4,、單品文獻(xiàn)100+，認(rèn)可度高,。

PART 3 封片和觀察

（1）脫水：80%,、95%、100%,、100%酒精,，每步5min、二甲苯5min,、重復(fù)兩次,。

（2）中性樹脂封片：在玻片上滴加一滴中性樹脂，從側(cè)邊緩緩蓋上蓋玻片,，動作應(yīng)盡量緩慢,，以防止產(chǎn)生氣泡。

IHC常見問題

【高背景】

1,、封閉問題

封閉不好是最常見的導(dǎo)致高背景的原因,，切記要注意以下幾個方面：首先封閉液的濃度我們可以適當(dāng)增加，并延長封閉時間,，來達(dá)到更好的封閉效果,；其次容易忽略的是我們通常采用稀釋的動物血清作為封閉液,，這時就要注意血清的種屬，最好使用與二抗同種屬來源,，切記不可使用與一抗同種屬來源,。

2、抗體濃度

有時一抗的濃度太高會導(dǎo)致較高的背景,，因此我們可以在原有一抗?jié)舛鹊幕A(chǔ)上提高稀釋度,，并減少抗體孵育的時間，來達(dá)到降低背景的目的,。當(dāng)然這也和抗體的效價有關(guān),，記得認(rèn)真查看抗體廠家的建議稀釋比。

3,、內(nèi)源性物質(zhì)影響

常見的為內(nèi)源過氧化物酶和內(nèi)源生物素,，記得要使用H2O2和Avidin來進(jìn)行封閉處理（abs9333和abs9335）。

【信號弱】

1,、抗體影響

廠家在生產(chǎn)抗體的時候會做抗體應(yīng)用檢測,，記得查看自己的抗體是否能運用于IHC；其次,，抗體的效價較弱,，這是我們可以通過提高抗體濃度來增強結(jié)果的信號；最后,，大家切記在保存熒光二抗的時候要避光,。

2、樣本保存

應(yīng)選擇新鮮組織進(jìn)行實驗,，樣品取出后應(yīng)盡快放入固定液中,。固定液現(xiàn)用現(xiàn)配。

3,、樣本個體差異
從Uniprot或者Atlas網(wǎng)站上查看蛋白的定位,，修飾等信息，并查詢蛋白在不同種屬和組織間的表達(dá)情況,?；蛘呖梢韵仁褂闷渌椒ǎㄈ鏦B，F(xiàn)low等）對樣品先進(jìn)行篩選或設(shè)立陽性對照,。

【樣本形態(tài)不好】

1,、掉片問題

如果出現(xiàn)樣本切片掉片問題，記得使用多聚賴氨酸（abs9170）處理過的玻片,，可以有效防脫,。另外石蠟切片要注意烤片的溫度和時間，以60℃，2-4個小時為最佳,。

2,、固定問題

固定時一定要保證固定的時間和固定液（abs9179）的體積，固定時間至少在8小時以上,，同時固定液的體積至少要是組織塊的20倍左右。

3,、抗原修復(fù)問題

抗原修復(fù)不要使用太過劇烈的條件,，尤其是對于一些硬質(zhì)組織樣本，本身比較容易脫片,?？梢赃m當(dāng)摸索下修復(fù)時間。

常用熱賣貨號

Absin產(chǎn)品線：

爆款產(chǎn)品：試劑盒(mIHC,、IHC、凋亡,、ELISA,、ChIP、Co-IP,、TR-FRET,、生化檢測、殘留檢測,、多因子檢測),；細(xì)胞培養(yǎng)(類器官試劑盒+基質(zhì)膠，胎牛血清+培養(yǎng)添加劑+細(xì)胞因子),、分化試劑盒,；分子(mRNA合成服務(wù)+提取試劑盒)；化合物大包裝,；輔助試劑,、耗材/儀器、定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測)...

特色產(chǎn)品：雞胚提取物CEE,、B27,、N2、霍亂毒素B亞單位CTB,、牛腦垂體提取物BPE,、百日咳毒素PTX、重組人胰島素Insulin,、人源低密度脂蛋白LDL...