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在之前的文章中，小愛為大家介紹了IHC的原理以及樣本處理的實驗要點：答應我,，看完再做IHC（上）今天我們繼續(xù)看看接下來的實驗流程及操作要點。首先還是先來回顧一下IHC的整體流程：

前期樣品處理的過程包括載玻片的制備,，脫蠟/復水,，抗原修復（上期內(nèi)容），然后我們需要做樣品的封閉,，孵育一抗和二抗,，以及底物檢測，最后的處理步驟包括脫水,，封片和觀察,。PART1我們介紹了樣品制備環(huán)節(jié)，今天我們繼續(xù)看下PART2抗體孵育及檢測,。

PART2 抗體孵育及檢測

（1）淬滅：如果使用基于酶或者生物素的檢測系統(tǒng),，樣本中內(nèi)源性酶的活性（過氧化物酶/堿性磷酸酶）或者內(nèi)源性生物素會對檢測產(chǎn)生非特異性干擾，因此在血清封閉之前需要先對樣品進行淬滅,。根據(jù)使用的二抗偶聯(lián)標記不同,，使用對應的內(nèi)源性封閉液進行淬滅。

小技巧：使用免疫組化筆在樣本周圍畫圈建立疏水隔離區(qū),，可以避免樣品間的交叉染色和節(jié)約血清和抗體的用量,。
 

操作步驟：將組織切片畫上阻水圈，每切片加100μL（用量以浸沒樣本區(qū)域為準,，可靈活調(diào)節(jié)） 3% H2O2,，室溫下孵育10min，PBST浸洗3min×3次,。

（2）封閉：使用血清對樣品中非特異性結(jié)合位點進行封閉,。一般建議在TBST/PBST中加入5%的山羊血清作為封閉液。

需要注意如果使用酪蛋白封閉液（例如牛奶）,，可能會影響磷酸化抗體的識別,。

操作步驟：每張切片加100μL（用量以浸沒樣本區(qū)域為準，可靈活調(diào)節(jié)）5%山羊血清封閉液,，室溫孵育30min,。

（3）孵育一抗：抗體孵育可以選擇直標一抗的方式或者無標記的一抗再偶聯(lián)HRP標記的二抗。間接檢測的方式可以進行信號放大,，靈敏度更高,，是更為常規(guī)的檢測方式,。一抗用于與樣品中的靶標抗原進行特異性結(jié)合。

在選擇IHC一抗的時候應注意以下幾點：

1,、一抗的反應種屬：一抗的反應種屬應與樣品的種屬一致,，并且一抗的宿主來源不同于樣品種屬。例如：如果樣品是小鼠的腫瘤,，應選擇針對于小鼠的抗體；

2,、一抗的特異性：抗體的特異性不好,，容易引起非特異性染色，單克隆抗體的特異性優(yōu)于多克隆抗體,。標記mAb的一般是指單克隆抗體,；

3、查看抗體說明：查看抗體說明書上面的應用,，注意有些抗體僅適用于IHC-P而不適用于IHC-F,，根據(jù)樣本類型進行選擇；例如下面這個抗體可以適用于IHC-P,。

操作步驟：在樣品處加入稀釋后的目的蛋白抗體,，置入4℃冰箱內(nèi)過夜，PBST浸洗3min×3次,。

（4）孵育二抗：二抗與一抗結(jié)合,，并帶有偶聯(lián)標記。

在選擇IHC二抗的時候應注意以下幾點：

a. 二抗的反應種屬應與一抗的宿主來源相同,；

b. 多標IHC/IF實驗中,，建議優(yōu)先選擇經(jīng)過預吸附處理的二抗，可以避免不同物種間抗體的交叉反應,；

c. 某些細胞和組織（巨噬細胞,、B細胞、自然殺傷細胞,，淋巴結(jié)組織,，脾臟組織等）表面內(nèi)源性的Fc端受體過多，建議使用F(ab')?形式的二抗以避免其與樣品Fc受體非特異性結(jié)合,。

操作步驟：在樣品上添加對應的二抗,，室溫孵育1h，PBST浸洗3min×3次,。

（5）底物檢測：IHC通過酶和底物反應在抗體結(jié)合處顯色以檢測抗原表達,。顯色檢測中需要根據(jù)抗體上的偶聯(lián)標記來選擇對應的底物，常見的偶聯(lián)標記有HRP和AP,。二抗上帶有HRP標記時,，一般選擇DAB作為底物進行檢測,。

操作步驟：配制即用型DAB工作液，滴加新鮮配制的DAB工作液到切片上,，wan全覆蓋標本,。通常顯色1-10min，DAB顯色時間需要鏡下控制,，選擇最佳顯色時間,，做好防護。自來水沖洗終止DAB顯色反應,。

（6）蘇木素復染：蘇木素經(jīng)氧化后生成蘇木精,，是一種堿性染料，組織學中用于細胞核的染色,，染色后的細胞核呈鮮明的藍色或藍紫色,，可以更方便的查看細胞形態(tài)。

操作步驟：滴加適量蘇木素以覆蓋整個組織,，復染 30sec~3min,。用自來水wan全沖洗掉復染液。酸酒精（在100ml 70%乙醇中加入1ml鹽酸）分化3-5sec后水洗30sec,，終止反應,。去離子水沖洗切片 3~5min，使胞核返藍,。

明星產(chǎn)品：免疫組化二抗試劑盒（abs957）

二抗檢測試劑盒用于IHC實驗,，包含經(jīng)過條件摸索和實驗驗證的最佳搭配試劑和實驗方案，試劑盒中包含淬滅劑,，封閉液,，一抗放大劑，酶標二抗聚合物和顯色底物,。由于IHC實驗一般信號較弱,，需要信號放大，建議使用二抗檢測試劑盒,。

1,、減少一抗用量，一抗可再稀釋2-4倍,；

2,、Polymer酶標二抗檢測系統(tǒng)，更低背景,；

3,、快速便捷，更短孵育時間,，鼠兔通用,；

4,、單品文獻100+，認可度高,。

PART 3 封片和觀察

（1）脫水：80%,、95%、100%,、100%酒精,，每步5min、二甲苯5min,、重復兩次。

（2）中性樹脂封片：在玻片上滴加一滴中性樹脂,，從側(cè)邊緩緩蓋上蓋玻片,，動作應盡量緩慢，以防止產(chǎn)生氣泡,。

IHC常見問題

【高背景】

1,、封閉問題

封閉不好是最常見的導致高背景的原因，切記要注意以下幾個方面：首先封閉液的濃度我們可以適當增加,，并延長封閉時間,，來達到更好的封閉效果；其次容易忽略的是我們通常采用稀釋的動物血清作為封閉液,，這時就要注意血清的種屬,，最好使用與二抗同種屬來源，切記不可使用與一抗同種屬來源,。

2,、抗體濃度

有時一抗的濃度太高會導致較高的背景，因此我們可以在原有一抗?jié)舛鹊幕A(chǔ)上提高稀釋度,，并減少抗體孵育的時間,，來達到降低背景的目的。當然這也和抗體的效價有關(guān),，記得認真查看抗體廠家的建議稀釋比,。

3、內(nèi)源性物質(zhì)影響

常見的為內(nèi)源過氧化物酶和內(nèi)源生物素,，記得要使用H2O2和Avidin來進行封閉處理（abs9333和abs9335）,。

【信號弱】

1、抗體影響

廠家在生產(chǎn)抗體的時候會做抗體應用檢測,，記得查看自己的抗體是否能運用于IHC,；其次,，抗體的效價較弱，這是我們可以通過提高抗體濃度來增強結(jié)果的信號,；最后,，大家切記在保存熒光二抗的時候要避光。

2,、樣本保存

應選擇新鮮組織進行實驗,，樣品取出后應盡快放入固定液中。固定液現(xiàn)用現(xiàn)配,。

3,、樣本個體差異
從Uniprot或者Atlas網(wǎng)站上查看蛋白的定位，修飾等信息,，并查詢蛋白在不同種屬和組織間的表達情況,。或者可以先使用其他方法（如WB,，F(xiàn)low等）對樣品先進行篩選或設(shè)立陽性對照,。

【樣本形態(tài)不好】

1、掉片問題

如果出現(xiàn)樣本切片掉片問題,，記得使用多聚賴氨酸（abs9170）處理過的玻片,，可以有效防脫。另外石蠟切片要注意烤片的溫度和時間,，以60℃,，2-4個小時為最佳。

2,、固定問題

固定時一定要保證固定的時間和固定液（abs9179）的體積,，固定時間至少在8小時以上，同時固定液的體積至少要是組織塊的20倍左右,。

3,、抗原修復問題

抗原修復不要使用太過劇烈的條件，尤其是對于一些硬質(zhì)組織樣本,，本身比較容易脫片,。可以適當摸索下修復時間,。

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