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IHC實(shí)驗(yàn)是科研人bi備的實(shí)驗(yàn)技能之一,，然而IHC實(shí)驗(yàn)流程復(fù)雜,，而且經(jīng)常出現(xiàn)假陰性的結(jié)果，常常讓人頭疼,。為此特別給大家整理了一份IHC實(shí)驗(yàn)詳解,，原理，步驟,，注意事項(xiàng)及操作視頻一網(wǎng)打盡,，想做IHC實(shí)驗(yàn)只看這篇就夠了（分為上下兩篇哦）。

IHC實(shí)驗(yàn)原理

免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry,，IHC)：利用抗原－抗體特異性結(jié)合的原理,，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑顯色以確定細(xì)胞內(nèi)抗原，并對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究,。和WB實(shí)驗(yàn)相比,，IHC實(shí)驗(yàn)可以更為直觀的展現(xiàn)待測(cè)蛋白的表達(dá)量和位置，也常用于病理診斷,。

表1 WB實(shí)驗(yàn)和IHC實(shí)驗(yàn)比較

IHC樣本類(lèi)型

IHC實(shí)驗(yàn)根據(jù)樣本類(lèi)型可以分為石蠟切片免疫組化(IHC-P)和冰凍切片免疫組化(IHC-F),，石蠟切片免疫組化雖然操作更加復(fù)雜，但其可以更好的保持組織的形態(tài)結(jié)構(gòu),，厚度更薄便于染色和觀察,，以及可以常溫保存多年的優(yōu)點(diǎn)，在實(shí)驗(yàn)中更為常用,。IHC-P和IHC-F的區(qū)別如下表：

表2 IHC-P和IHC-F實(shí)驗(yàn)比較

IHC實(shí)驗(yàn)流程

IHC-P由于前期需要用醛類(lèi)固定和石蠟包埋，因此前期樣品處理時(shí)需要有脫蠟復(fù)水和抗原修復(fù)的步驟,，IHC-F則可以直接用OCT包埋劑包埋進(jìn)行切片和固定,，可省略抗原修復(fù)的過(guò)程，后面的步驟基本一致,。IHC-P的實(shí)驗(yàn)步驟如下圖所示：

PART 1 樣本制備

（篇幅有限,，本文僅介紹樣本制備過(guò)程，后面的流程將在以后繼續(xù)介紹）
石蠟組織樣本的制備流程和冰凍組織樣本略有不同,，步驟可參考下圖：
 

1,、石蠟組織樣本：

（1）固定：可以使用4%多聚甲醛進(jìn)行在體灌流的方式，或者把組織取出之后,，盡快放入4%多聚甲醛或者10%中性福爾馬林中進(jìn)行固定,。固定液的體積一般為組織體積的20倍，固定時(shí)間為室溫4-48h,。組織的體積不宜過(guò)大（不超過(guò)5*5mm2）,，以免影響后續(xù)的操作；

（2）脫水透明：使用梯度乙醇和二甲苯對(duì)樣品進(jìn)行脫水和透明處理,。將組織修剪后置于脫水盒內(nèi),，依次放置于以下溶液中：75%乙醇（1h）——85%乙醇（1h）——95%乙醇（1h）——100%乙醇（50min）——100%乙醇（50min）——100%乙醇（50min）——二甲苯（40min）——二甲苯（40min）——二甲苯（40min）——63℃石蠟（50min）——63℃石蠟（50min）——63℃石蠟（50min）；

（3）浸蠟包埋：脫水結(jié)束后放入預(yù)熱的包埋機(jī),，按要求確定包埋方向進(jìn)行包埋,，置于冷凍臺(tái)冷卻；

（4）切片：將修整好的蠟塊放入切片機(jī)中進(jìn)行切片,，切片的厚度為3-5um,，將切片漂浮于40℃溫水上展平組織,，用粘附載玻片將組織撈起，置于60℃烘箱中進(jìn)行烤片1-2h,；

（5）脫蠟復(fù)水：使用二甲苯和梯度乙醇進(jìn)行脫蠟和復(fù)水處理,。將切片放置于切片架內(nèi)，依次分別置于以下溶液中：二甲苯（5min）——二甲苯（5min）——二甲苯（5min）——100%乙醇（5min）——100%乙醇（5min）——95%乙醇（3min）——85%乙醇（3min）——75%乙醇（3min）——去離子水（5min),；

（6）抗原修復(fù)：

組織樣本在固定時(shí)形成的蛋白間交聯(lián)會(huì)限制抗體和抗原結(jié)合,，需要通過(guò)抗原修復(fù)的過(guò)程使抗原暴露出來(lái)?？乖迯?fù)的方法一般分為熱修復(fù)和酶解修復(fù),。

熱修復(fù)：熱修復(fù)可使用微波爐或高壓鍋對(duì)樣品進(jìn)行加熱煮沸，常用的緩沖液為PH6的檸檬酸鹽或者PH8的EDTA緩沖液,。熱修復(fù)適用于大多數(shù)實(shí)驗(yàn),，檸檬酸鹽較為溫和，更為常用,；EDTA適用于多數(shù)磷酸化酪氨酸特異性抗體和較難檢測(cè)出的抗原,。（具體修復(fù)液的選擇和處理時(shí)間參考一抗說(shuō)明書(shū)）

酶解修復(fù)：胃蛋白酶，胰蛋白酶,，蛋白酶K進(jìn)行酶解作用也可進(jìn)行抗原修復(fù),。酶解修復(fù)易受溫度影響，操作更難控制,，一般適合于較難修復(fù)的抗原表位,。
操作步驟：將切片置于切片架內(nèi)，放入裝有修復(fù)液的燒杯中,，放入微波爐高火5-8min,，常溫5min，中火5min,，室溫冷卻30min,。

2、冰凍組織樣本：

（1）OCT包埋：-80℃保存的組織提前半小時(shí)-20℃緩慢解凍后OCT包埋,，固定組織經(jīng)蔗糖溶液脫水后進(jìn)行OCT包埋,，新鮮組織濾紙吸干水分后可直接進(jìn)行OCT包埋。樣本脫上滴少量OCT后,，將組織切面朝上置于樣本脫上,，組織周?chē)紊螼CT包埋劑全部覆蓋組織,，將樣本托放在速凍臺(tái)上快速冷凍包埋,，大約冷凍10-20min，OCT變白變硬后即可進(jìn)行切片,。

（2）切片：將樣本托固定于切片機(jī)上,，先粗修將組織面修切平整修到目的觀察部位后即可開(kāi)始切片，將組織貼于防脫載玻片上，室溫晾干,，37℃烤箱烘烤10-20min,。

（3）固定：用4%PFA或者甲醇固定20min。