2022年,，“生物大分子與微生物組"被列為國(guó)自然重點(diǎn)項(xiàng)目,，由此掀起了空間蛋白組學(xué)技術(shù)的研究熱潮，其中免疫組織化學(xué)（IHC,，Immunohistochemistry）作為最早的空間蛋白組學(xué)技術(shù),，衍生出了很多新興的研究方法。IHC是利用抗原-抗體特異性結(jié)合的原理,，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑顯色以確定細(xì)胞內(nèi)抗原,，并對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究,。
隨著空間蛋白組學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,，利用IHC進(jìn)行的傳統(tǒng)多標(biāo)記方案，也就是在連續(xù)切片上進(jìn)行單標(biāo)染色,，很明顯已經(jīng)不能適用于研究人員的高通量檢測(cè)需求,。于是，mIHC技術(shù)就應(yīng)運(yùn)而生了,，它可以做到在一個(gè)樣本中進(jìn)行多重?zé)晒馊旧?。相比于傳統(tǒng)的組化技術(shù)，mIHC在復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境中蛋白表達(dá)和共定位分析或其他生理過程中有較高應(yīng)用價(jià)值,，尤其是在樣本數(shù)較少的情況下,，可以做到同時(shí)檢測(cè)多達(dá)10種熒光染料。
目前,，mIHC有兩大技術(shù)——經(jīng)典的TSA技術(shù)和新興的SignalStar技術(shù),。那么，這兩種技術(shù)我們?cè)撛趺慈ミx擇呢,？接下來就帶大家一起來看看吧～
Part 01 TSA技術(shù)簡(jiǎn)介
1．TSA技術(shù)原理
酪氨酸信號(hào)放大 (Tyramide dignal amplification,，TSA) 技術(shù)，是利用辣根過氧化酶 (Horseradish Peroxidase, HRP) 對(duì)靶蛋白進(jìn)行高密度原位標(biāo)記的酶學(xué)檢測(cè)方法,。簡(jiǎn)單來說,，就是利用二抗上帶有的HRP（而不是直接偶聯(lián)熒光素），來催化后續(xù)添加入體系的非活性熒光素,。熒光素在HRP和過氧化氫的作用下被活化,，跟臨近蛋白的酪氨酸殘基共價(jià)偶聯(lián)，使得蛋白樣品與熒光素穩(wěn)定結(jié)合,；然后微波清洗,，前一輪非共價(jià)結(jié)合的抗體被洗掉，共價(jià)結(jié)合的熒光素還留存在樣品上,。再換個(gè)一抗來第二輪孵育,，周而復(fù)始,。等到所有抗體孵育結(jié)束，熒光素都結(jié)合好后,，最后去檢測(cè)結(jié)果,。
圖1 TSA技術(shù)原理圖
2. TSA操作步驟
1）使用TSA技術(shù)，你需要準(zhǔn)備：嚴(yán)格驗(yàn)證的高特異性抗體,、HRP偶聯(lián)的針對(duì)一抗種屬亞型特異的二抗、酪胺熒光素,、多光譜成像系統(tǒng),；
2）孵育一抗二抗：利用二抗上帶有的HRP催化后續(xù)添加入體系的非活性酪胺熒光素；
3）加入酪胺：酪胺熒光素在HRP和過氧化氫的作用下被活化,，跟臨近蛋白的酪氨酸殘基共價(jià)偶聯(lián),，使得蛋白樣品與熒光素穩(wěn)定結(jié)合；
4）微波清洗：通過微波清洗去除已連接的一抗和二抗,，共價(jià)結(jié)合的熒光素還留存在樣品上,，再孵育新的靶點(diǎn)的一抗和二抗；
5）檢測(cè)：等到所有抗體孵育結(jié)束,，熒光素都結(jié)合好后,，使用熒光顯微鏡檢測(cè)結(jié)果。
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Part 02 SignalStar™ Multiplex IHC技術(shù)簡(jiǎn)介
1. SignalStar技術(shù)原理
SignalStar技術(shù)是使用帶有寡核苷酸標(biāo)簽的特異性抗體,，結(jié)合du有的信號(hào)放大系統(tǒng)并使用熒光成像檢測(cè)的多重免疫組化（mIHC) 技術(shù)，可在常規(guī)FFPE樣本中同時(shí)檢測(cè)3-8個(gè)靶標(biāo)蛋白,，且兼容常見下游成像平臺(tái)及分析軟件,。
圖2 對(duì)石蠟包埋的人胃腺癌進(jìn)行 SignalStar™ 多重免疫組化分析結(jié)果圖
2. SignalStar操作步驟
1）將寡核苷酸偶聯(lián)的抗體加入到經(jīng)過脫蠟，復(fù)水以及抗原修復(fù)處理的FFPE組織中,；
2） 一次添加所有抗體,，然后進(jìn)行溫和固定；
3）互補(bǔ)寡核苷酸與前4個(gè)抗體的偶聯(lián)標(biāo)簽雜交,；
4）使用熒光寡核苷酸產(chǎn)生并放大信號(hào)(AF488, AF594, AF647, AF750),；
5）寡核苷酸連接；
6）寡核苷酸特異性酶去除所有熒光信號(hào),；
7）互補(bǔ)寡核苷酸與偶聯(lián)抗體上的寡核苷酸標(biāo)簽進(jìn)行第二輪雜交,；
8）使用熒光寡核苷酸產(chǎn)生并放大信號(hào)(AF488, AF594, AF647, AF750)；
9）寡核苷酸連接,。
圖3 SignalStar™實(shí)驗(yàn)流程圖
Part 03 TSA 技術(shù)vs SignalStar技術(shù)
TSA技術(shù)與SignalStar技術(shù)各有優(yōu)缺點(diǎn),，對(duì)比如下：
TSA | SignalStar |
同時(shí)標(biāo)記多種蛋白（最多9標(biāo)10色） | 同時(shí)標(biāo)記多種蛋白（最多8標(biāo)9色） |
一抗來源不再受限（同種屬多標(biāo)） | 一抗來源不再受限（同種屬多標(biāo)） |
連接辣根過氧化物酶的同種屬二抗 | 熒光寡核苷酸不會(huì)導(dǎo)致表位遮蔽 |
強(qiáng)熒光防淬滅（無需避光操作） | 抗體一次性添加，節(jié)省時(shí)間 |
檢測(cè)靈敏度超高,，成倍提高熒光信號(hào)（增強(qiáng)10-1000倍） | 檢測(cè)靈敏度超高 |
驗(yàn)證靶標(biāo)多 | 組織結(jié)構(gòu),、抗原不容易破壞 |
成本較低 | 優(yōu)化過的實(shí)驗(yàn)方案,，試劑齊全，傻瓜式操作,，開箱即用 |
實(shí)驗(yàn)流程耗時(shí)長(zhǎng) | 驗(yàn)證靶標(biāo)有限 |
對(duì)于研究者來說,，進(jìn)行mIHC實(shí)驗(yàn)需要準(zhǔn)備抗體和多重?zé)晒舛乖噭┖校梢蕴峁?-7色的多色試劑盒及輔助試劑,。除此之外,，我們還可提供mIHC整體解決方案，包括試劑,、服務(wù)等等,。其中，愛必信多色服務(wù)最多九指標(biāo)十色（含DAPI）的多重?zé)晒饷庖呓M化服務(wù),，樣本種屬涵蓋人,、小鼠、大鼠,、豬等,；組織類型以腫瘤樣本居多，涵蓋肺,、胃,、肝、腎,、腸等各大器官,，甲狀腺、胰腺,、唇腺,、淚腺等各大腺體，另還有眼球,、神經(jīng),、大腦等特殊樣本；切片類型涵蓋石蠟切片,、組織芯片（TMA）,、冰凍切片、大組織切片,、厚切片等,，并提供全片掃描和定量分析。
圖4 Absin全景多靶點(diǎn)染色成像分析平臺(tái)
Part 04常見問題解答
Q1：波修復(fù)抗原每一輪染色都要做嗎,？可以用抗體洗脫液替代嗎,？抗體洗脫液用在哪個(gè)步驟？
A1：染第一個(gè)抗體之前做抗原修復(fù),，是為了使被石蠟或者固定劑封閉的抗原決定簇重新暴露出來,，使得抗體能夠識(shí)別到抗原,；在染后面每一個(gè)抗體之前的抗原修復(fù)，目的是為了去除掉上一輪染色的抗體和殘留沒有結(jié)合上的染料,，其實(shí)更準(zhǔn)確的叫法是“抗體洗脫",，也就是說第一次的抗原修復(fù)是真正的抗原修復(fù)，后面的抗原修復(fù)實(shí)際上是“抗體洗脫",，“抗體洗脫"可以用抗體洗脫液(abs994)替換,，特別是細(xì)胞、冰凍切片或者骨樣本,，但第一次抗原修復(fù)不能被抗體洗脫液替代,，冰凍切片可以不進(jìn)行抗原修復(fù)，染色效果欠佳時(shí),，可以考慮嘗試進(jìn)行抗原修復(fù),，推薦冰凍切片快速抗原修復(fù)液(5×)(abs9207),。
Q2：脫蠟水合步驟中“10%中性福爾馬林浸片10min,，滅菌水洗片1min，重復(fù)3次"目的是什么,？我們以前做石蠟切片的時(shí)候沒有這一步,。
A2：這是后固定的步驟，固定充分的組織可以省略此步,。
Q3：做好的多色片子,，無法進(jìn)行及時(shí)掃描，該如何保存,？
A3：需要避光防震,，在4℃條件下保存。
Q4：樣本可以做成冰凍切片嗎,？
A4：可以的,。抗原修復(fù)步驟不推薦用加熱的方法,，推薦用抗體洗脫液(abs994)
Q5：所有操作要避光嗎,？
A5：不需要，在常規(guī)環(huán)境下操作就可以,，染料的熒光強(qiáng)度很高,。
Q6：抗體修復(fù)液每一輪修復(fù)都要更換嗎？
A6：是的,，每一輪都要根據(jù)抗體選擇相應(yīng)的修復(fù)液,。
Q7：染料的選擇會(huì)影響后染色嗎，有共定位的話怎么辦,？
A7：共定位的情況,，我們可以通過單一通道觀察來更好的檢測(cè)各指標(biāo)的分布情況,，染料不會(huì)對(duì)染色有影響，串色的情況需要預(yù)實(shí)驗(yàn)做充足,，包括抗體稀釋比例,，染料與放大液比例，修復(fù)條件的確定,。
Q8：多色用的一二抗各是什么種屬,？
A8：多色的優(yōu)勢(shì)在于一二抗種屬無需特別要求，一抗根據(jù)樣本種屬選擇既可,，二抗根據(jù)一抗選擇即可,，多個(gè)抗體組合，種屬不會(huì)有影響,。
Q9：抗體洗脫和微波修復(fù)哪種方式洗脫效果更好,？
A9：微波修復(fù)洗脫更穩(wěn)定，抗體洗脫液對(duì)大多數(shù)抗體都管用,，難洗的抗體延長(zhǎng)洗脫時(shí)間就可以啦,！
Q10：我的組織還有GFP蛋白，給結(jié)果的時(shí)候能排除干擾嗎,？
A10：可以的,，結(jié)果分析的時(shí)候可以避免綠色通道，分析軟件賦予的顏色是偽彩色,，可以更換其他顏色,。
Q11：在指標(biāo)與染料的搭配以及染色順序上，有什么規(guī)律嗎,？
A11：并沒有一個(gè)特別的線性關(guān)系,，和蛋白的種類、表達(dá)量以及修復(fù)條件都有關(guān)系,，所以會(huì)多因素考慮,，多嘗試，預(yù)實(shí)驗(yàn)很重要,。
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