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Wsetern Blot可以說(shuō)是科研人的必修課,，已經(jīng)修煉的得心應(yīng)手，但是遇到磷酸化蛋白的WB卻開(kāi)始痛苦面具,，一問(wèn)一個(gè)不吱聲,，接下來(lái)小愛(ài)帶大家深度剖析磷酸化蛋白的WB是怎么個(gè)事！

蛋白質(zhì)磷酸化修飾：

是指在激酶的催化作用下,，將ATP的磷酸根基團(tuán),，轉(zhuǎn)移到蛋白的氨基酸側(cè)鏈上，這個(gè)過(guò)程一般是可逆的,，可通過(guò)磷酸酶去除蛋白磷酸化修飾,。蛋白的磷酸化修飾通常發(fā)生在絲氨酸、蘇氨酸,、酪氨酸上,。蛋白質(zhì)磷酸化的修飾可以改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和活性，從而影響細(xì)胞的代謝,、增殖,、分化等生理過(guò)程，是調(diào)節(jié)和控制蛋白質(zhì)活力和功能的最基本,、很普遍,，也是最重要的機(jī)制。目前涉及到的主要研究包括,，疾病機(jī)制研究,、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)研究、藥物研發(fā),、發(fā)育生物學(xué),、應(yīng)激響應(yīng)等。

蛋白磷酸化示意圖

為什么磷酸化蛋白的WB不好做,？

1）磷酸化蛋白的豐度通常較低,，大概只有總蛋白量的10%,，甚至更低；

2）蛋白磷酸化修飾可逆,，細(xì)胞一旦裂解,，蛋白酶和磷酸酶會(huì)立即釋放，使磷酸化蛋白質(zhì)可以在幾毫秒內(nèi)去磷酸化,。

磷酸化蛋白WB,，慎之又慎

1、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備——充分了解自己的研究對(duì)象

一般通過(guò)查閱文獻(xiàn)或者借助數(shù)據(jù)庫(kù)了解研究蛋白的磷酸化位點(diǎn)及水平,，這里推薦大家使用PhosphoSitePlus ——蛋白翻譯后修飾綜合性預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù),，只需輸入蛋白名稱(chēng)，可以查詢(xún)?cè)摰鞍赘鞣N修飾類(lèi)型,，以及位點(diǎn)信息,，以及其他的數(shù)據(jù)。對(duì)于表達(dá)水平較低的,，可通過(guò)物理或化學(xué)方法進(jìn)行一定的刺激和誘導(dǎo),。

PhosphoSitePlus數(shù)據(jù)庫(kù)

2、樣品處理,，走好第一步

1）樣品要新鮮；

2）操作要迅速,；

3）試劑器具要預(yù)冷,，冰上操作；

4）盡量不要用超聲波細(xì)胞破碎儀處理細(xì)胞,，組織研磨要提前用液氮預(yù)冷研缽,；

5）裂解液中一定要有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，缺一不可,；

6）注意有的磷酸化蛋白上能不要煮沸,，否則會(huì)破壞其磷酸化位點(diǎn)；

7）測(cè)定濃度后,，加入上樣buffer,，分裝，凍存于-80度,，避免反復(fù)凍融,。

3、內(nèi)參

需要設(shè)置兩個(gè)內(nèi)參,，一個(gè)是磷酸化蛋白對(duì)應(yīng)的總蛋白,，因?yàn)橹粰z測(cè)到磷酸化蛋白表達(dá)量的變化不能說(shuō)明問(wèn)題，只有磷酸化蛋白與總蛋白比值變化了才能說(shuō)明磷酸化水平的變化,；另一個(gè)是普通內(nèi)參,，作為體系的對(duì)照,。但是分孔上樣比較時(shí)誤差還是較大，常用的方法,，是用一抗二抗去除液將原先結(jié)合上的磷酸化抗體及二抗洗去,，然后用同一張膜壓總蛋白。然后再洗脫一次,，再壓內(nèi)標(biāo),。

CREB1磷酸化CREB1在模型大鼠PFC的表達(dá)

4、上樣,，量要足

磷酸化蛋白和普通WB相比,，磷酸化水平較低，所以上樣量要足,。

5,、封閉，看準(zhǔn)再下手

牛奶中含有一種磷蛋白即酪蛋白,，會(huì)引起高背景,，在進(jìn)行磷酸化蛋白檢測(cè)時(shí)建議使用牛血清白蛋白BSA或無(wú)蛋白的封閉劑。當(dāng)然如果抗體上標(biāo)注了建議,，遵循建議也可以,。

6、抗體孵育

因?yàn)榱姿峄鞍滓豢棺詈?℃過(guò)夜孵育,，保證抗體有充分的結(jié)合時(shí)間,，4℃過(guò)夜，蛋白抗原不容易從膜上脫落,。二抗則室溫1h即可,。

7、洗滌,，這種細(xì)節(jié)也有講究

建議初次實(shí)驗(yàn)減小洗滌次數(shù)和搖床轉(zhuǎn)速,，有背景總比孵不出來(lái)強(qiáng)，后期可以適當(dāng)優(yōu)化,，得到比較理想的效果,。

Pan B, Zhu X, Han B, Weng J, Wang Y, Liu Y. The SIK1/CRTC2/CREB1 and TWIST1/PI3K/Akt/GSK3β signaling pathways mediated by microRNA-25-3p are altered in the schizophrenic rat brain. Front Cell Neurosci. 2023 Jan 20;17:1087335. doi: 10.3389/fncel.2023.1087335. PMID: 36744005; PMCID: PMC9896578.

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