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概述

隨著大家實驗對類器官模型的需求越來越多,，類器官培養(yǎng)已經(jīng)成為我們必要的一項實驗技能。然而,，類器官培養(yǎng)相對細胞復雜,，諸多的細節(jié)需要注意，需要一個詳細的流程來指導我們快速掌握類器官培養(yǎng)技術,。不同種類的類器官培養(yǎng)步驟大同小異,，因此我們掌握了通用方法，在不同類器官上適當調(diào)整操作步驟即可,，今天小愛為大家奉上最詳類器官培養(yǎng)攻略,，不看遺憾一萬年吶！??！

流程

類器官有多種培養(yǎng)方法，比如使用超低吸附培養(yǎng)板和生物反應器,，基質(zhì)膠法等,，今天咱來講一講基質(zhì)膠法。

類器官原代培養(yǎng)流程

原代（以人腸癌類器官為例）

一,、準備工作

1,、儀器設備

CO₂ 培養(yǎng)箱、雙人單面超凈臺,、倒置顯微鏡,、臺式冷凍離心機、水浴鍋(abs72023)或水浴搖床，醫(yī)用冰箱,、-80℃冰箱,、移液器（一套）、眼科剪,、眼科鑷。

2,、試劑耗材（以腸癌為例）

人腸癌類器官培養(yǎng)基試劑盒(abs9445),，基質(zhì)膠（低因子、無酚紅）(abs9495),，60mm細胞培養(yǎng)皿(abs7005),， 100μm濾篩(abs7009)，15mL離心管(abs7102),，1.5mL EP管若干(abs7119),，24孔細胞培養(yǎng)板(abs7058)、金屬冰盒,、眼科剪刀,、眼科鑷。

二,、操作流程

1,、樣本準備

（1）將組織放入含有預冷的（2-8°C）組織保存液E的取樣瓶中（浸沒整個組織），4℃從醫(yī)院/實驗室取回。

（2）將取樣瓶消毒,，組織取出放入培養(yǎng)皿樣本拍照，并登記,，大小,，顏色，軟硬程度,，組織類型等信息,。

2、清洗-剪碎

（1）在60mm細胞培養(yǎng)皿(abs7005)里用2-3mL原代培養(yǎng)緩沖液B浸泡,。用原代培養(yǎng)緩沖液B清洗三次（每次更換培養(yǎng)皿）后剪碎,，剪成大約1-3mm³的組織塊，轉移至15mL離心管,。

3,、消化-過濾

（2）向15mL離心管中加入5倍人腸癌原代組織消化液 C（消化液體積：組織體積=5:1，如果估量組織體積困難,，使用5mL消化液通常足夠）在37℃進行消化15-30min（消化過程中隨時觀察消化情況）,。

（3）取少量液體在顯微鏡下觀察，鏡下觀察到較多的細胞團（5-50個細胞抱團）后， 加入3倍體積原代培養(yǎng)緩沖液B （緩沖液體積：消化液體積=3:1）終止消化,，用槍頭輕柔吹打可以看到液體變渾濁,。

（4）使用100μm濾篩(abs7009)進行過濾，取少量濾液在鏡下進行觀察,。將濾液收集到15mL離心管,，于300g 4℃富集離心5min后移去上清。

4,、加膠-點板-加液（這里是整個原代操作的點睛之筆）

（1）準備工作

a 基質(zhì)膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過夜融化

b 槍頭,、離心管需要-20℃提前預冷至少半小時

c 融化后的基質(zhì)膠可一直放4℃儲存，建議2周內(nèi)用完

低溫金屬冰盒(abs7289)

（2）接種要求

24孔板(abs7035),，每孔25uL基質(zhì)膠細胞團混合物,，500-750uL類器官培養(yǎng)液

（3）接種密度

密度建議1：基質(zhì)膠體積：細胞團沉淀體積=25:1（如果估摸細胞團沉淀體積困難，通常加300uL基質(zhì)膠足夠）

密度建議2：500個細胞團/25uL基質(zhì)膠（如果想計數(shù)接種,，可以參照此密度建議）

（4）加膠-點板

向細胞團沉淀加入基質(zhì)膠(abs9495),，進行吹打混勻（不要滿吹滿打，容易產(chǎn)生氣泡）,，然后進行點板,。整個操作在金屬冰盒或冰上進行。操作熟練以后,，加膠,，混勻，點板控制在半分鐘內(nèi),，有利于保持基質(zhì)膠良好的流暢性,。

（5）加液

將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中40-60min成膠，添加500-750μL人腸癌類器官培養(yǎng)基A進行培養(yǎng),。大概10-14天,，多數(shù)類器官直徑在200um-500um，可進行傳代操作,。

人結腸癌-10x鋪板密度

傳代（消化分兩種情況）

一,、類器官數(shù)量較多或體積較大傳代步驟

1、類器官收集及洗滌

1）收集：移液器吸去培養(yǎng)基,，每孔添加1-2mL左右4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G,，輕柔吹散基質(zhì)膠，收集在15mL離心管中（24孔板,，每5孔為一組）,。

2）洗滌：加類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G定容至14mL（緩沖液越多，基質(zhì)膠被稀釋的越充分,，越容易去除）,，4℃靜置40min或-20℃放置5min（目的是使基質(zhì)膠軟化,，如果冰箱保溫效果強，縮短冷凍時間,，摸索合適的冷凍時間時,，可取出離心管搖晃看不到基質(zhì)膠說明冷化好了）。

3）接下來將離心管進行300g,，4℃,，離心5min，離心完通常會有這兩種情況：

第一種是正常情況,，分成三層（如下圖）,，此時棄掉上清和基質(zhì)膠層，保留類器官沉淀即可,。

第二種是不正常情況，分成兩層（如下圖）,，這種情況可能與冷化不充分有關,。此時棄掉緩沖液，留下基質(zhì)膠類器官混懸液,，重復上一步洗滌步驟,，再次冷化離心，通常能出現(xiàn)清晰分層（緩沖液層,、基質(zhì)膠層,、類器官沉淀層），此時棄掉上清和基質(zhì)膠層,，保留類器官沉淀即可,。如果依然是兩層（緩沖液層和基質(zhì)膠類器官混懸液層），此時棄掉緩沖液和上1/3的基質(zhì)膠類器官混懸液,，保留下2/3即可,。

促進基質(zhì)膠和類器官有效分離條件：

a 離心機的選擇非常重要，水平角離心機相比固定角離心機更利于基質(zhì)膠和類器官分離,；

b 離心機的溫度最好是4℃（可避免基質(zhì)膠固化）,，離心轉速可適當提高（最高不要超過500g），離心時間可適當加長（最常不超過10min）,。

2,、類器官消化

1）添加2-3mL類器官傳代消化液D于超凈臺內(nèi)消化2-3min，消化期間吹打1-2次,。此步驟以消化成細胞團為主,，千萬不要消化成單細胞，單細胞類器官存活率低,。如果不確定是否消化適宜,，可吸取數(shù)微升鏡下觀察,，如果有較多細胞團可停止消化。

2）添加5倍類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G（緩沖液：消化液=5:1）終止消化,，300g 4℃離心5min棄去上清（如果有基質(zhì)膠殘留,，殘留量<50uL正常，不影響傳代類器官增殖）

3,、加膠-點板-加液

（1）準備工作

a 基質(zhì)膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過夜融化

b 槍頭,、離心管需要-20℃提前預冷至少半小時

c 融化后的基質(zhì)膠可一直放4℃儲存，建議2周內(nèi)用完

（2）接種要求

24孔板(abs7035),，每孔25uL基質(zhì)膠細胞團混合物,，500-750uL類器官培養(yǎng)液

（3）接種密度

密度建議1： 類器官通常按1:2傳代，例如,，24孔板收集5孔,，傳代10孔，需要的基質(zhì)膠量25*10=250uL,。

密度建議2：500個細胞團/25uL基質(zhì)膠（如果想計數(shù)接種,，可以參照此密度建議）

注意：不管是按密度建議1還是，密度建議2,，如果有殘留的基質(zhì)膠,，新膠量至少是殘留膠量的1.5倍

（4）加膠-點板

向細胞團沉淀加入基質(zhì)膠(abs9495)，進行吹打混勻（不要滿吹滿打,，容易產(chǎn)生氣泡）,，然后進行點板。整個操作在金屬冰盒或冰上進行,。操作熟練以后,，加膠，混勻,，點板控制在半分鐘內(nèi),，有利于保持基質(zhì)膠良好的流暢性。

（5）加液

將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中40-60min成膠,，添加500-750μL人腸癌類器官培養(yǎng)基A進行培養(yǎng),。大概10-14天，多數(shù)類器官直徑在200-300um,，可進行傳代操作,。

二、類器官數(shù)量不足或體積較小時：

1,、類器官收集,、吹打、洗滌

（1）移液器吸去培養(yǎng)基,，每孔添加1-2mL左右4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G,，輕柔吹散基質(zhì)膠,。

（2）進行吹打，將類器官吹成細胞團（可取樣鏡下觀察有較多細胞團時可停止吹打）,；

（3）洗滌： 24孔板,，每5孔為一組，收集在15mL離心管中,，加類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G定容至14mL（緩沖液越多,，基質(zhì)膠被稀釋的越充分，越容易去除）,，4℃靜置 40min或-20℃放置5min（目的是使基質(zhì)膠軟化,，如果冰箱保溫效果強，縮短冷凍時間,，摸索合適的冷凍時間時,，可取出離心管搖晃看不到基質(zhì)膠說明冷化好了）。

（4）接下來將離心管進行300g,，4℃,，離心5min，離心完通常會有這兩種情況：

第一種是正常情況,，分成三層（如下圖）,，此時棄掉上清和基質(zhì)膠層,，保留細胞團沉淀即可,。

第二種是不正常情況，分成兩層（如下圖）,，這種情況可能與冷化不充分有關,。此時棄掉緩沖液，留下基質(zhì)膠類器官混懸液,，重復上一步洗滌步驟,，再次冷化離心，通常能出現(xiàn)清晰分層（緩沖液層,、基質(zhì)膠層,、類器官沉淀層），此時棄掉上清和基質(zhì)膠層,，保留類器官沉淀即可,。如果依然是兩層（緩沖液層和基質(zhì)膠細胞團混懸液層），此時棄掉緩沖液和上1/3的基質(zhì)膠細胞團混懸液,，保留下2/3即可,。

促進基質(zhì)膠和類器官有效分離條件：

a離心機的選擇非常重要，水平角離心機相比固定角離心機更利于基質(zhì)膠和類器官分離,；

b離心機的溫度最好是4℃（可避免基質(zhì)膠固化）,，離心轉速可適當提高（最高不要超過500g）,，離心時間可適當加長（最常不超過10min）。

2,、加膠-點板-加液

（1）準備工作

a 基質(zhì)膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過夜融化

b 槍頭,、離心管需要-20℃提前預冷至少半小時

c 融化后的基質(zhì)膠可一直放4℃儲存，建議2周內(nèi)用完

（2）接種要求

24孔板(abs7035),，每孔25uL基質(zhì)膠細胞團混合物,，500-750uL類器官培養(yǎng)液

（3）接種密度

密度建議1： 對于類器官數(shù)量較少的情況，為了維持生長所需的旁分泌信號,，需要2-3孔富集到1孔,，例如，24孔板收集6孔,，2孔富集1孔,，鋪3孔，需要的基質(zhì)膠量25*3=75uL,。

密度建議2：500個細胞團/25uL基質(zhì)膠（如果想計數(shù)接種,，可以參照此密度建議）

注意：不管是按密度建議1還是按密度建議2，如果有殘留的基質(zhì)膠,，新膠量至少是殘留膠量的1.5倍

（4）加膠-點板

向細胞團沉淀加入基質(zhì)膠(abs9495),，進行吹打混勻（不要滿吹滿打，容易產(chǎn)生氣泡）,，然后進行點板,。整個操作在金屬冰盒或冰上進行。操作熟練以后,，加膠,，混勻，點板控制在半分鐘內(nèi),，有利于保持基質(zhì)膠良好的流暢性,。

（5）加液

將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中40-60min成膠，添加500-750μL人腸癌類器官培養(yǎng)基A進行培養(yǎng),。大概7-10天,，多數(shù)類器官直徑在200-300um，可進行再次傳代,。

凍存

凍存要領：

類器官不需要消化（消化后的類器官復蘇活率低）,；

在類器官指數(shù)增長期凍存（等到該傳代的時候類器官活性比指數(shù)期差），也就傳代后的Day3-Day4,，多數(shù)類器官直徑在100um-200um,，這個時機選擇凍存。

一,、類器官收集及洗滌

1,、收集：移液器吸去培養(yǎng)基,，每孔添加1-2mL左右4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G，輕柔吹散基質(zhì)膠,，收集在15mL離心管中（24孔板,，每5孔為一組）。

2,、洗滌：加類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G定容至14mL（緩沖液越多,，基質(zhì)膠被稀釋的越充分，越容易去除）,，4℃靜置 40min或-20℃放置5min（目的是使基質(zhì)膠軟化,，如果冰箱保溫效果強，縮短冷凍時間,，摸索合適的冷凍時間時,，可取出離心管搖晃看不到基質(zhì)膠說明冷化好了）。

3,、接下來將離心管進行300g,，4℃，離心5min,，離心完通常會有這兩種情況：

第一種是正常情況,，分成三層（如下圖），此時棄掉上清和基質(zhì)膠層,，保留類器官沉淀即可,。

第二種是不正常情況，分成兩層（如下圖）,，這種情況可能與冷化不充分有關,。此時棄掉緩沖液,，留下基質(zhì)膠類器官混懸液,，重復上一步洗滌步驟，再次冷化離心,，通常能出現(xiàn)清晰分層（緩沖液層,、基質(zhì)膠層、類器官沉淀層）,，此時棄掉上清和基質(zhì)膠層,，保留類器官沉淀即可。如果依然是兩層（緩沖液層和基質(zhì)膠類器官混懸液層）,，此時棄掉緩沖液和上1/3的基質(zhì)膠類器官混懸液,，保留下2/3即可。

促進基質(zhì)膠和類器官有效分離條件：

a 離心機的選擇非常重要,，水平角離心機相比固定角離心機更利于基質(zhì)膠和類器官分離,；

b 離心機的溫度最好是4℃（可避免基質(zhì)膠固化）,，離心轉速可適當提高（最高不要超過500g），離心時間可適當加長（最常不超過10min）,。

二,、類器官凍存

1、凍存密度,，以24孔板為例

密度建議1:2孔/mL凍存液

密度建議2:500個類器官/mL凍存液（如果想計數(shù)凍存,，可以參照此密度建議）

2、添加適量類器官凍存液F,，輕柔吹打重懸,，建議立即進行凍存。（放置太久,，DMSO對類器官有損傷）

3,、梯度凍存：將凍存管放入梯度凍存盒然后保存至-80℃過夜，第二天取出放入液氮罐,。

      手動凍存：4℃冰箱放置30min,，轉移至-20℃放置1h，然后移至-80℃過夜,，第二天取出放入液氮罐,。

復蘇

一、實驗前準備

1,、將水浴鍋預熱至37℃,；

2、細胞實驗室進行常規(guī)消毒,，用預防噴霧噴涂并且使用紫外線照射40min的超凈工作臺臺面,；

3、在超凈工作臺中按次序擺好消過毒的離心管,、吸管,、培養(yǎng)板等。

二,、取出凍存管

1,、根據(jù)類器官凍存記錄按標簽找到所需類器官的編號。

2,、從液氮罐中取出凍存盒,，取出所需的凍存管，同時核對凍存管外的編號,。

三,、迅速解凍

1、迅速將凍存管投入到已經(jīng)預熱的水浴鍋中解凍，并要不斷地搖動,，使管中地液體迅速融化,。

2、約1-2min后凍存管內(nèi)液體充分溶解,，取出用酒精棉球擦拭凍存管地外壁,，再拿入超凈臺內(nèi)。

四,、將類器官凍存液移入15mL離心管,，添加10倍體積類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G（緩沖液體積：凍存液體積=10:1）重懸，輕柔吹打混勻,，300g 4℃離心5min,，棄上清。

五,、加膠-點板-加液

1,、準備工作

（1）基質(zhì)膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過夜融化

（2）槍頭、離心管需要-20℃提前預冷至少半小時

（3）融化后的基質(zhì)膠可一直放4℃儲存,，建議2周內(nèi)用完

2,、復蘇要求

24孔板(abs7035)，每孔25uL基質(zhì)膠類器官混合物,，500-750uL類器官培養(yǎng)液

3,、復蘇密度

復蘇密度建議1：1:1接種（原來凍幾孔就復蘇幾孔）

復蘇密度建議2：250個類器官/25uL基質(zhì)膠（如果想計數(shù)接種，可以參照此密度建議）

4,、加膠-點板

向類器官沉淀加入基質(zhì)膠(abs9495),，進行吹打混勻（不要滿吹滿打，容易產(chǎn)生氣泡）,，然后進行點板,。整個操作在金屬冰盒或冰上進行。操作熟練以后,，加膠,，混勻，點板控制在半分鐘內(nèi),，有利于保持基質(zhì)膠良好的流暢性,。

5,、加液

將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中40-60min成膠,，添加500-750μL人腸癌類器官培養(yǎng)基A進行培養(yǎng)。大概10-14天,，多數(shù)類器官直徑在200um-500um,，可進行傳代操作。

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