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背景介紹

隨著腫瘤的急劇生長,，其內(nèi)部血液供應(yīng)嚴重不足,，導(dǎo)致氧氣的輸送受到很大程度的抑制，最終使得腫瘤內(nèi)微環(huán)境明顯乏氧,。因此,，乏氧是晚期實體腫瘤的一個重要環(huán)境特征，不僅會促進腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，同時也是腫瘤治療過程中的主要障礙之一,。因此,，調(diào)節(jié)腫瘤部位乏氧狀態(tài)被認為是一種改善癌癥治療效果的有效策略（圖1）。

圖1 腫瘤血管常態(tài)化,。腫瘤血管(左)和正常血管(右)

腫瘤乏氧標志物

乏氧與腫瘤細胞內(nèi)生物還原酶的活性密切相關(guān),，多種生物還原酶通常會過度表達。此外,，乏氧通常也會導(dǎo)致腫瘤其他微環(huán)境參數(shù)發(fā)生變化,，如pH值降低、間質(zhì)流體壓力升高,、糖酵解和還原能力增強等,。

分子探針能對乏氧進行可視化檢測，有望實現(xiàn)乏氧腫瘤的準確影像,。目前,，可激活腫瘤乏氧分子探針的物質(zhì)包括基于硝基還原酶 (Nitroreductase，NTR),、基于偶氮還原酶 (Azoreductase) 和基于氫醌還原酶 (Quinone Oxidoreductase,，hNQO1) 的乏氧分子探針（圖2）。

圖2 腫瘤乏氧相關(guān)標志物^[1]

腫瘤乏氧緩解策略

近年來,，眾多學(xué)者嘗試以新型納米生物材料為載體將分子氧輸送到腫瘤組織或催化氧氣原位生成,，以提高腫瘤治療療效。根據(jù)腫瘤部位氧氣補充方式,，李從虎等^[2]提出3種基于納米材料緩解腫瘤乏氧的策略：①腫瘤微環(huán)境的重塑（內(nèi)源氧補充）,；②納米氧載體靶向遞送（外源氧輸送）；③原位氧氣催化再生,。

例如腫瘤微環(huán)境的重塑主要是3種設(shè)計思路：利用納米載體輸送抗血管生成藥物,，使腫瘤血管正常化,；利用具有光熱效應(yīng)的納米材料進行光熱治療,；利用納米載體輸送蛋白酶類物質(zhì)，破壞腫瘤組織處的ECM,，使血管舒張,，增加腫瘤的血流灌注。如CONG等^[3]預(yù)先在小鼠瘤內(nèi)注射透明質(zhì)酸酶 (hyaluronidase,，HAase),，隨后尾靜脈注射光敏劑二氫卟吩e6 (chlorine e6，Ce6) 偶聯(lián)的納米粒 (NM-Ce6),，結(jié)果顯示HAase可有效分解腫瘤處致密的HA,，增加腫瘤血管密度,，促進氧氣的擴散和粒子的滲透。

細胞缺氧檢測試劑盒

Absin公司熱賣生化試劑—熒光探針與染料系列,，新上兩種探針試劑盒：細胞缺氧檢測試劑盒-紅色熒光和細胞缺氧檢測試劑盒-綠色熒光,，助力廣大科研學(xué)者在細胞缺氧方面的研究工作。下面小愛以細胞缺氧檢測試劑盒-紅色熒光為例,，詳細介紹該試劑盒的使用方法,。

產(chǎn)品簡介：

細胞缺氧檢測試劑盒是一種利用紅色熒光探針進行細胞缺氧狀態(tài)檢測的試劑盒。O92熒光探針可自由透過活細胞膜進入細胞內(nèi),，并與細胞內(nèi)的缺氧損傷產(chǎn)物反應(yīng),，形成紅色熒光產(chǎn)物，產(chǎn)生紅色熒光,。紅色熒光隨著缺氧程度的增加而增強。因此,，根據(jù)活細胞中紅色熒光的產(chǎn)生,，可以判斷細胞缺氧的變化。

O92在激發(fā)波長536nm,，發(fā)射波長580nm附近,，使用熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡,、熒光分光光度計,、熒光酶標儀、流式細胞儀等檢測熒光,，從而測定細胞內(nèi)缺氧狀況,。

適用范圍：

本試劑盒可以用于各種真核培養(yǎng)細胞、培養(yǎng)或灌流組織及新鮮組織振動切片以及冰凍切片的檢測,。

試劑盒特點：

1,、使用方便：可用激光共聚焦顯微鏡直接觀察、熒光分光光度計,、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測,；

2、背景低,，靈敏度高,；

3、線性范圍寬,，使用方便,。

使用方法：

儀器：熒光顯微鏡/流式細胞儀/激光共聚焦/熒光酶標儀、離心機,、移液器,、冰箱、冰盒；

試劑：PBS緩沖液或者HBSS,；

耗材：黑色透明底熒光專用96孔培養(yǎng)板,、離心管、吸頭,、一次性手套,；

O92探針標記：

1、O92溶液可在新鮮無血清培養(yǎng)液,、PBS,、HBSS、HEPES等緩沖鹽溶液中稀釋到所需濃度,，100-1000倍稀釋,，以此染色液更換細胞培養(yǎng)液；也可直接向細胞孵育液體中加入O92探針溶液至所需濃度,。
2,、依據(jù)細胞缺氧程度的不同，O92終濃度可選擇在100-1000倍稀釋的范圍,，孵育時間可選擇60-120min,，在37℃進行避光孵育。
3,、孵育結(jié)束后,，用新鮮溶液清洗細胞。
4,、檢測細胞熒光,。

共聚焦/熒光顯微鏡檢測：

對貼壁生長細胞或活組織，可直接在熒光顯微鏡下觀察,；對懸浮生長細胞,，取25-50μL細胞懸液滴到一張顯微載玻片上，再蓋上一張蓋玻片,。

熒光顯微鏡下,，用藍光或綠光激發(fā)，觀察和拍攝細胞紅色發(fā)射圖像,，缺氧細胞被染成紅色,。

流式細胞儀分析：

對貼壁生長細胞，用胰酶消化制備成單細胞懸液,；對懸浮生長細胞,，直接收集細胞。用0.5~1mL冷PBS重懸細胞（5~10萬）,。采用480~536nm波長激發(fā),，測定580nm~610nm的發(fā)射,。

陰性細胞僅有較低的熒光強度，缺氧細胞有較強的紅色熒光,。

[1] 陳華, 覃君霞, 譚必穗等. 腫瘤乏氧分子探針的研究進展[J].廣西科學(xué), 2023, 30(4):625-633.
[2] 李從虎, 馮夢夢, 楊妞妞等. 納米生物材料在腫瘤乏氧緩解策略中的研究進展[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志, 2023.
[3] GONG H, CHAO Y, XIANG J, et al. Hyaluronidase to enhance nanoparticle-based photodynamic tumor therapy [J]. Nano Lett, 2016, 16(4): 2512-2521．

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