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食品安全的重要性不言而喻,，而微生物檢測是食品安全檢驗的重要組成部分。在進行微生物檢測時,，首先要根據(jù)其性質(zhì)和特點,，選擇適合的微生物檢驗方法,，同時還要明確食品的污染狀況,、危害程度以及具體的檢驗項目和要求。

微生物檢測方法包括常規(guī)檢測法（如平板計數(shù)法,、涂片鏡檢,、分離培養(yǎng)、生化試驗,、血清學(xué)試驗等）,、免疫學(xué)方法,、分子生物學(xué)方法、代謝學(xué)技術(shù)等,。本期小愛向大家介紹2種常用的微生物檢測方法：平板計數(shù)法和流式檢測法,。

1、平板計數(shù)法

微生物平板計數(shù)常用3種培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,、高氏 (Gause)Ⅰ號培養(yǎng)基和Martin瓊脂培養(yǎng)基,。針對食品微生物檢測常用培養(yǎng)基的配制，應(yīng)當(dāng)根據(jù)不同檢驗?zāi)康?，選擇不同的配制材料,，常見的培養(yǎng)基材料配比如表1。在實際食品微生物檢驗過程中,，根據(jù)不同的需要對配制材料進行選擇,。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：主要用于食品微生物中細(xì)菌的培養(yǎng)。為保證培養(yǎng)基的質(zhì)量,，需要在125℃環(huán)境下持續(xù)進行15min的滅菌處理,。

高氏 (Gause)Ⅰ號培養(yǎng)基：主要用于放線菌的培養(yǎng)。在配制的過程中,，首先應(yīng)當(dāng)在淀粉中添加少量的冷水,，通過攪拌得到糊狀淀粉后，再將其倒入100℃的水中,，然后加熱并加入其余配制材料攪拌至溶化,。配制后同樣需要在125℃環(huán)境下持續(xù)進行15min的滅菌處理。

Martin瓊脂培養(yǎng)基：主要用于微生物中真菌的分離,，完成滅菌處理后,，在使用前加入0.02%鏈霉素稀釋液，通常為100~150mL,，保證每毫升培養(yǎng)基當(dāng)中均含有25μg鏈霉素,。

表1  73種常用培養(yǎng)基材料配比^[1]

然而,，平板計數(shù)法時效性不足,、難以區(qū)分死活、無法檢測非培養(yǎng)性微生物,。微生物活的非可培養(yǎng) (Viable but non-culturable,，VBNC) 狀態(tài)（圖1）給平板計數(shù)法帶來了挑戰(zhàn)，同時也吸引了越來越多學(xué)者的關(guān)注,。流式細(xì)胞術(shù)可解決平板計數(shù)法檢測不到VBNC狀態(tài)菌的問題,。

圖1 VBNC狀態(tài)的形成與復(fù)蘇

2 、流式檢測法

微生物的流式細(xì)胞儀檢測也是科學(xué)研究中比較常用的檢測技術(shù),。與真核生物細(xì)胞相比,，細(xì)菌等微生物的體積較小，其散射光難以與其他物質(zhì)的顆粒區(qū)分,。因此,，通過流式細(xì)胞儀的檢測依賴于與細(xì)胞結(jié)合的熒光染料，用于從背景中識別真正的目標(biāo)物,。

A：液流系統(tǒng),；B：光源系統(tǒng)；C：檢測和計算,、分析系統(tǒng)

圖2 流式細(xì)胞儀的組成及工作原理^[2]

根據(jù)熒光底物的不同,，適用于流式檢測法的熒光染料主要包括：結(jié)合核酸的染料，如PI,、7-AAD,；標(biāo)記抗體蛋白的染料，如Cy5,、FITC,、PE。不同的熒光染料具有不同的激發(fā)波長和發(fā)射波長,。流式細(xì)胞儀通常會配備多個激光器,，如405nm,、488nm,、633nm 等,。多激光器可實現(xiàn)多熒光通道分析，減少自發(fā)熒光干擾,、減少熒光信號之間的補償,，提高檢測靈敏度。

表2 微生物流式檢測常用染料

另外，流式細(xì)胞術(shù)熒光標(biāo)記的選擇還需考慮儀器配置的光源波長,、染料的亮度與靶標(biāo)表達(dá)量的匹配,、染料光譜重疊和樣本自發(fā)熒光等多重因素。

3,、7-AAD流式檢測原理及方法

7-AAD是一種核酸染料,，它在細(xì)胞凋亡和細(xì)胞死亡過程中會被釋放出來。當(dāng)細(xì)胞開始凋亡時,，其質(zhì)膜對7-AAD的通透性會逐漸增加,。在特定的波長激發(fā)下，7-AAD可以發(fā)出明亮的紅色熒光,。通過這種熒光的強度,，可以將細(xì)胞分為三個群體：7-AAD信號強的代表死亡細(xì)胞，7-AAD信號弱的則是處于凋亡狀態(tài)的細(xì)胞,，而沒有檢測到7-AAD信號的是正?；盍Φ募?xì)胞。

該操作步驟適用于大多數(shù)細(xì)胞,，但不同的細(xì)胞類型,、細(xì)胞密度、使用的培養(yǎng)基以及其他一些因素都有可能影響染色效果以下步驟僅供參考,。

1）儲存液的制備：取適量DMSO加入到7-AAD原瓶中配制成1-10mM儲存液,，分裝保存于-20℃，可穩(wěn)定保存6個月,；
2）根據(jù)自身樣本選擇合適的步驟固定細(xì)胞,。7-AAD染色一般在其它染色完成后再進行，且僅僅染色死細(xì)胞；
3）離心收集細(xì)胞,，并用合適的的緩沖鹽溶液或者培養(yǎng)基（pH=7.4）重懸細(xì)胞,；
注：貼壁細(xì)胞可在蓋玻片或者培養(yǎng)板上進行原位染色。
4）加入適量7-AAD染色液,，推薦該染料的工作濃度為0.5-5µM,，孵育15-60min；
注：實驗建議在推薦的工作濃度范圍內(nèi)設(shè)置濃度梯度檢測,，從而摸索最佳的染色濃度,。
5）根據(jù)其最大激發(fā)和發(fā)射波長（Ex/Em=545nm/650nm）在流式細(xì)胞儀下（FL3通道）檢測熒光強度。

圖3 用0.25μg/10⁶ cells 7-AAD復(fù)染,，流式檢測計算細(xì)胞死亡率^[3]

[1] 吳芳媛,馮秋芳,林黎.食品微生物檢驗常用培養(yǎng)基配制,滅菌及貯藏研究[J].食品安全導(dǎo)刊, 2020(36):1.
[2] 高惠敏,顏春榮,徐春祥,等.食品微生物檢驗中流式細(xì)胞術(shù)的研究進展[J].生物災(zāi)害科學(xué), 2023, 46(4): 549-556.
[3] Tian X X, Nanding K, Dai X Y, et al. Pattern recognition receptor mediated innate immune response requires a Rif-dependent pathway[J]. Journal of Autoimmunity, 134 (2023) 102975.  影響因子：14.511

微生物培養(yǎng)基原料：

流式檢測常用染料：

流式檢測常用串聯(lián)染料：

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