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背景介紹

過量飲酒會導致肝臟氧化應激,、脂肪堆積和炎癥,。隨著酒精性肝病 (ALD) 在全球的流行，ALD的研究迅速增加,。目前,，許多研究試圖發(fā)現(xiàn)有效治療ALD的藥物，包括使用抗炎,、抗氧化,、抗細胞凋亡和調節(jié)腸道微生物群的藥物。

甘油三脂檢測在ALD研究中的應用

肝脂積聚是酒精性肝病的主要病理特征之一,。先前的研究表明,，二甲雙胍通過抑制硬脂酰輔酶A脫飽和酶1 (SCD1) 或miR-33b的表達來抑制高糖和高胰島素誘導的肝細胞TG蓄積。還有研究表明,，二甲雙胍可以通過激活AMPK信號通路逆轉脂肪肝,。然而，其在ALD中的作用尚不清楚,。

Xie等^[1]采用一系列檢測手段探究了二甲雙胍調節(jié)酒精性肝病脂代謝的可能機制,。其中甘油三酯 (TG) 檢測試劑盒(abs580085)用于檢測細胞內TG的濃度，以確定二甲雙胍對ALD的影響,。

甘油三酯檢測試劑盒使用方法介紹

檢測原理：

甘油三酯 (TG) ,，也稱為三酰甘油三酯或三酰甘油酯，是植物油和動物脂肪中的主要成分,。在人體內,，血液中甘油三酯的高水平與動脈粥樣硬化、心臟病和胰腺炎有關,。試劑盒檢測原理是利用脂肪酶對甘油三酯進行水解,，產生甘油和游離脂肪酸。隨后通過偶聯(lián)酶促反應在500nm下比色讀數,，測定釋放甘油的量,，再換算成甘油三酯的含量。

備注：

1,、Enzyme：使用前加入9mL Diluent溶解,；
2,、Dye Reagent：使用前加入10mL Diluent溶解；
3,、Assay Buffer（未提供）：例如制備100mL緩沖液,，請將35mL庚烷和65mL異丙醇混合在一起。

操作步驟：

1,、試劑和材料

1）自備試劑：Assay Buffer（例如制備100mL緩沖液,，請將35mL庚烷和65mL異丙醇混合在一起。）
2）自備材料：酶標儀,、蒸餾水,、移液器與槍頭、離心機,、計時器等,。

2、樣品處理

1）細胞/細菌樣品：細胞/細菌（5×10⁶個）離心后棄上清,，加入1mL緩沖液,，超聲處理（功率20%，超聲處理3s,，間隔10s,，重復30次）后,，4℃,、10000g離心10min，取上清轉移至新離心管中,，置于冰上待檢測,；
2）組織樣品：稱取0.1g組織，加入1mL緩沖液,，冰上勻漿后,，4℃、10000g離心10min,，將上清液轉移至新的離心管中,，置于冰上待檢測；

3）血清/血漿樣品：直接置于冰上待檢測,。

3,、標準曲線制備

用蒸餾水對試劑盒提供的標準品（5mmol/L）進行2倍連續(xù)稀釋，形成標準曲線,。

4,、樣品預實驗

對于未知的樣品，濃度可能在很大的范圍內變化,。建議多做幾個稀釋梯度進行預實驗,，以確保讀數在標準曲線范圍內,。

5、樣品檢測

按照以下方式加樣完成后,，蓋上板膠帶,，混合均勻。將96孔板放入37℃的烘箱中反應10min,，隨后用酶標儀在500nm下檢測吸光值,。

6、樣品濃度計算

樣品濃度計算試劑盒說明書中提供兩種計算方式：標準曲線法,、公式法,。

針對說明書既有計算公式又有標曲的試劑盒，兩種方式任選一種就可以,，公式是簡便算法,。建議按照標曲計算，雖然比較麻煩且耗費試劑,，但檢測結果會更加準確,。按照標曲計算，每一次都需要重新做標曲,，因為這種反應是一個變化的過程,，檢測的數值會隨著反應時間、溫度等產生變化,。

圖 甘油三酯檢測標準曲線示例（檢測限：0.1mmol/L-5mmol/L）

常見問題解答

Q1：我想要檢測肝臟細胞在處理后,，合成甘油三酯的能力是否改變，我的理解是一方面要檢測細胞內的甘油三酯,，另一方面也要檢測細胞分泌到培養(yǎng)液中的甘油三酯,，那么我是不是應該把我處理后的細胞沉淀收取，培養(yǎng)上清也一并保留,，這么理解對嗎,？

A1：理論上是的，既然既要檢測細胞內的又要檢測分泌出來的,，那肯定是要一并保留上清和細胞的,。

Q2：如果是將細胞上清收集后檢測，那么按照細胞培養(yǎng)上清樣品的檢測方法,，我的培養(yǎng)上清稀釋倍數是需要通過預實驗來確定嗎,？

A2：稀釋倍數都是要通過預實驗來確定的。

Q3：Enzyme和Dye Reagent都是粉末狀,，需要溶解,，其中Dye Reagent說明書提示建議現(xiàn)用現(xiàn)配，那我如果想要做預實驗的話,，這兩種試劑溶解后,，都能夠放在-80℃保存嗎,？

A3：這樣操作是對的，特別是酶,，溶解后在-80 ℃保存最好,。需要注意的是染料不管是低溫還是高溫都會氧化，建議老師預實驗做完盡早開展實驗,，一次性多測些樣品,，防止試劑溶解后長期儲存影響檢測效果。

Q4：TG試劑盒里面的檢測板可以拆分嗎,？因為如果要做預實驗摸索稀釋倍數的話,，可能只做幾個孔。

A4：板子不能拆分,，但是可以用常規(guī)的96孔酶標板替代做預實驗,。

Q5：該試劑盒可以檢測組織樣本，對組織樣本的保存有什么要求嗎,？

A5：沒有什么特殊要求,，新鮮或者液氮速凍的組織都可以。

[1] Xie F , Zhong Y , Wang D ,et al. Metformin protects against ethanol-induced liver triglyceride accumulation by the LKB1/AMPK/ACC pathway[J].Molecular biology reports, 2022,49(8):7837-7848.

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