日韩av大片在线观看欧美成人不卡|午夜先锋看片|中国女人18毛片水多|免费xx高潮喷水|国产大片美女av|丰满老熟妇好大bbbbbbbbbbb|人妻上司四区|japanese人妻少妇乱中文|少妇做爰喷水高潮受不了|美女人妻被颜射的视频,亚洲国产精品久久艾草一,俄罗斯6一一11萝裸体自慰,午夜三级理论在线观看无码

概述：

類器官傳代是一個(gè)痛點(diǎn),，經(jīng)常出現(xiàn)傳代后類器官丟失，類器官不長(zhǎng)也不死,，類器官凋亡,。究其原因，主要是兩大類,，一類是類器官消化過(guò)度,，一類是基質(zhì)膠殘留太多，和類器官難以分離,，導(dǎo)致丟失嚴(yán)重,。今天給大家分享類器官在傳代過(guò)程中需要注意關(guān)鍵事項(xiàng)！

實(shí)驗(yàn)步驟：

不同類器官的培養(yǎng)難易程度不同,，所以傳代時(shí)要根據(jù)類器官培養(yǎng)狀態(tài)具體情況具體分析,，大致分為兩種情況，第一種情況是類器官數(shù)量不足或體積較小時(shí),，不建議消化,，我們可以來(lái)看一組類器官圖片。

圖1 類器官數(shù)量不足或體積較小圖

一,、類器官數(shù)量不足或體積較小時(shí)：

1,、類器官收集及洗滌

1）移液器吸去培養(yǎng)基，每孔添加1-2mL左右4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液(abs9730),，輕柔吹散基質(zhì)膠,，收集在15mL離心管中（24孔板，每5孔為一組）,；

2）進(jìn)行吹打,，將類器官吹成細(xì)胞團(tuán)（可取樣置于顯微鏡下觀察是否吹打成細(xì)胞團(tuán)）；

3）加類器官傳代培養(yǎng)緩沖液(abs9730)定容至14mL（緩沖液越多,，基質(zhì)膠被稀釋的越充分,，越容易去除），4℃靜置40min或-20℃放置5min（目的是使基質(zhì)膠軟化,，如果冰箱冷凍效果強(qiáng),，冷凍3min），300g,，4℃,， 離心5min棄上清,，進(jìn)行第三步。注：如基質(zhì)膠去除不理想,，此步驟可再重復(fù)1-2次,。

圖2 囊泡型類器官吹打傳代后圖片

圖3 致密型類器官吹打傳代后圖片

2、類器官鋪板

對(duì)于類器官較少的情況,，需要3-5孔富集到1孔,，例如24孔板收集6孔，傳代2孔,，需要的基質(zhì)膠量25*2=50uL,，每孔25μL基質(zhì)膠鋪細(xì)胞團(tuán)混懸物在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，放置培養(yǎng)箱中40-60min,，添加500μL-750uL類器官培養(yǎng)基,。

第二種情況是類器官數(shù)量較多或體積較大時(shí)，建議消化,，我們可以來(lái)看一組類器官圖片,。

圖4 類器官數(shù)量較多或體積較大圖片

二、類器官數(shù)量較多或體積較大時(shí)：

1,、類器官收集及洗滌

1）移液器吸去培養(yǎng)基,，每孔添加1-2mL左右4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液(abs9730)，輕柔吹散基質(zhì)膠,，收集在15mL離心管中（24孔板,，每5孔為一組）（如圖所示）。

2）加類器官傳代培養(yǎng)緩沖液定容至14mL（緩沖液越多,，基質(zhì)膠被稀釋的越充分,，越容易去除），4℃靜置40min或-20℃放置5min（目的是使基質(zhì)膠軟化,，如果冰箱冷凍效果強(qiáng),，冷凍3min），300g,，4℃,，離心5min棄上清。

圖

2,、類器官消化

1）添加適量類器官傳代消化液(abs9520)（是類器官懸液的1-2倍）超凈臺(tái)內(nèi)消化2-3min（中間可以吹打1-2次）（如圖7） ,；

2）添加適量類器官傳代培養(yǎng)緩沖液（緩沖液G：傳代消化液D=5:1）終止消化，300g 4℃離心5min棄去上清,；注：此步驟如果殘留膠過(guò)多（大于50uL）,，可重復(fù)類器官收集及洗滌的第2步1-2遍（如圖8,、9）,；

3）添加1mL類器官傳代培養(yǎng)緩沖液重懸移入5mL（如圖10）離心管,，300g，4℃離心5min,，棄上清,。

三、類器官鋪板

類器官通常按1:2傳代,，例如24孔板收集5孔,，傳代10孔，需要的基質(zhì)膠量25*10=250uL,，每孔25μL（如圖11）基質(zhì)膠鋪細(xì)胞團(tuán)混懸物在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,，放置培養(yǎng)箱中40-60min，添加500μL-750uL（如圖12）類器官培養(yǎng)基,。

消化傳代后的類器官如下圖所示

圖 ICC經(jīng)消化傳代后的鋪板圖

四,、類器官傳代后增殖現(xiàn)象

常見問(wèn)題：

1、收集的基質(zhì)膠類器官離心后正常分成幾層,？

答：正常離心后會(huì)分成3層（如下圖）：緩沖液,、基質(zhì)膠、類器官沉淀,，留類器官沉淀即可,。

2、收集的基質(zhì)膠與類器官離心后不分層是什么原因,？

答：因素很多,，例如類器官數(shù)量量少，體積小,，降溫時(shí)間不夠,，基質(zhì)膠粘稠等因素，離心后往往兩層（如下圖）,。如果反復(fù)清洗離心,，基質(zhì)膠和類器官仍未分離，可保留基質(zhì)膠類器官混懸物下2/3傳代,。（上1/3基本是原代細(xì)胞雜質(zhì)或死細(xì)胞）

3,、如何有效地分離基質(zhì)和類器官？可從以下幾點(diǎn)著手：

1,、加盡可能多的緩沖液（例如15mL離心管,，緩沖液加到14mL），稀釋基質(zhì)膠類器官混合物,，能促進(jìn)分離,；

2、將基質(zhì)膠類器官混合物放于-20℃，5min（注意：如果冰箱冷凍效果強(qiáng),，冷凍3min）,，加速基質(zhì)膠液化，能促進(jìn)分離,；

3,、離心機(jī)的選擇非常重要，水平角離心機(jī)相比固定角離心機(jī)更利于基質(zhì)膠和類器官分離,；

4,、離心機(jī)的溫度最好是4℃（可避免基質(zhì)膠固化），離心轉(zhuǎn)速可適當(dāng)提高（最高不要超過(guò)500g）,，離心時(shí)間可適當(dāng)加長(zhǎng)（最常不超過(guò)10min）,。

今天講解就到這了，大家如有類器官問(wèn)題,，歡迎公眾號(hào)后臺(tái)“愛必信生物"留言哦,！

本期小愛推薦：

好消息,！Absin文獻(xiàn)獎(jiǎng)勵(lì)重磅升級(jí),！

Absin特色產(chǎn)品線：

WB相關(guān)：ECL發(fā)光液、預(yù)染marker,、預(yù)制膠,；IHC相關(guān)：二抗試劑盒、組化筆,；IP/CoIP試劑盒,；激動(dòng)劑/抑制劑；血清,、BSA,、蛋白酶K、CTB,、TTX,、CEE；凋亡試劑盒,；呼吸爆發(fā)試劑盒,；ELISA試劑盒；重組蛋白,；抗體: 二抗,、標(biāo)簽抗體、對(duì)照抗體,；定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測(cè))...