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腦類器官概述：

11月末，小愛曾為大家講述了3D類器官培養(yǎng),，相信大家對“類器官"及“3D培養(yǎng)"已不陌生?，F(xiàn)階段，類器官的培養(yǎng)有多種不同的方法,，而不同類器官的培養(yǎng)亦存在一定的差異,，包括：視網(wǎng)膜、腸,、甲狀腺,、肝、垂體,、大腦...等,。

以人腦為例，因其具有高度復(fù)雜性,，現(xiàn)如今,，很多腦部疾病的研究很難在生物模型中開展，故體外模擬技術(shù)成為現(xiàn)在類器官培養(yǎng)領(lǐng)域的一項前沿技術(shù),。通常,，研究人員可在體外環(huán)境中對大腦組織進行培育，模擬大腦發(fā)育過程,，進而能夠觀察到人腦變化,，為更深層次的腦部研究開拓思路。

接下來,，小愛將為大家送上一份冬日秘籍：Nature protocol 技術(shù)干貨,，為大家重點解析人腦類器官的培養(yǎng)過程。

ips誘導(dǎo)腦類器官流程：

圖1 大腦類器官培養(yǎng)流程

1,、培育EB ● 1-2h

1）在六孔板的一孔中培育hESC或iPSC克隆,，至匯合度為70-80％。一般而言,，六孔板的一個孔可以產(chǎn)出大約整個96孔板所需的EB,。

流程A，通過feeder依賴的PSCs培育EB,；流程B,，通過feeder非依賴的hESC培育EB。關(guān)鍵步驟：干細胞集落的形態(tài)對于腦組織形成的成功至關(guān)重要,。菌落應(yīng)無分化跡象,，并應(yīng)顯示多能性的最佳特征（圖2）,。

feeder依賴的PSCs培育EB

圖2 人PSCs培育的大腦類器官發(fā)育進程

◆ 洗滌細胞，去除hESC培養(yǎng)基,，加1mL不含鈣和鎂的D-PBS,。后去除D-PBS，向6孔板的每個孔中加入1mL分散酶溶液,，然后將細胞放回培養(yǎng)箱中孵育20-30min,；
◆ 去除分散酶溶液，加入1mL低bFGF的hESC培養(yǎng)基,。輕輕敲擊培養(yǎng)皿,，以去除培養(yǎng)皿上的克隆而不移除MEF和已分化細胞。將含有完整克隆的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至15mL錐形管,，靜置約1min使得克隆沉降到試管底部,；

◆ 輕輕吸出含有單細胞和MEF的上清液，注意不要干擾貼壁的細胞克隆,。另添加1mL低bFGF的hESC培養(yǎng)基,，再次使克隆沉降，后去除上清液,；
◆ 將克隆重懸于1mL的胰蛋白酶消化液（0.25%,，含酚紅）中，并在37°C下孵育2min,。加入1mL的胰蛋白酶抑制劑,，并使用1mL移液器吹打混合溶液，直到溶液中出現(xiàn)單細胞渾濁為止,。取兩次5uL的細胞溶液進行計數(shù),，然后加入8mL低bFGF的hESC培養(yǎng)基；
◆ 在室溫下以270×g離心細胞5min,，同時加入等體積的臺盼藍標(biāo)記死細胞。使用血細胞計數(shù)器或自動細胞計數(shù)器對細胞進行計數(shù),。使用兩次計數(shù)的平均值,；
◆ 首先將細胞重懸于含有ROCK抑制劑（1:100，終濃度50uM）的1mL低bFGF的hESC培養(yǎng)基中,，多次吹打以確?；靹騿渭毎麘乙骸Ｈ缓筇砑宇~外適量的帶有ROCK抑制劑的低bFGF的hESC培養(yǎng)基,，以每150uL懸液獲得9000個活細胞,；
◆ 低貼壁型的96孔板，每個孔中加入150uL懸液,，后將其放回培養(yǎng)箱中,。

feeder非依賴的hESCs培育EB

◆ 用1mL不含鈣和鎂的D-PBS洗滌細胞,，并在六孔板的每個孔添加600uL不含鈣和鎂的0.5mM EDTA溶液，后將細胞放回培養(yǎng)箱中孵育4min,；
◆ 輕輕吸出EDTA溶液而不干擾細胞克隆,，后加入1mL的Accutase酶。將細胞放回培養(yǎng)箱中孵育4min,；
◆ 采用1mL的mTeSR1培養(yǎng)基吹打細胞克隆,，使其與培養(yǎng)皿分離。取其中2mL轉(zhuǎn)移到15mL錐形管中,，并使用1mL移液器吹打混合溶液,，直到溶液中出現(xiàn)單細胞渾濁為止。取兩次5uL的細胞溶液進行計數(shù),，后添加3mL mTeSR1培養(yǎng)基并混合均勻,；
◆ 在室溫下以270×g離心細胞5min，同時加入等體積的臺盼藍標(biāo)記死細胞,。使用血細胞計數(shù)器或自動細胞計數(shù)器對細胞進行計數(shù),。使用兩次計數(shù)的平均值；
◆ 首先用1mL含ROCK抑制劑的低bFGF的hESC培養(yǎng)基（1:100,，終濃度50uM）重懸細胞,，多次吹打以確保混勻單細胞懸液,。然后添加額外適量的帶有ROCK抑制劑的低bFGF的hESC培養(yǎng)基,，以每150uL懸液獲得9000個活細胞；
◆ 低貼壁型的96孔板,，每個孔中加入150uL懸液,，后將其放回培養(yǎng)箱中。

2,、培育EBs,，啟動細胞層分化 ● 5-7d

圖3 不同培養(yǎng)階段類器官形態(tài)

2）培育24h后在組織培養(yǎng)顯微鏡下觀察細胞板，可在鏡下觀測到邊界清晰的小規(guī)模EB,。繼續(xù)在組織培養(yǎng)箱中于37°C,、5％CO2條件下培養(yǎng)EB；
3）每隔一天輕輕吸去大約一半體積的培養(yǎng)基,，注意不能干擾底部的EB,，添加150uL新鮮培養(yǎng)基（最終體積>150uL即可，具體的量并不重要）,。加入ROCK抑制劑（1:100）和低bFGF培養(yǎng)基（4ng.mL-1）,，直到EB開始變亮或直徑大于350-400um?？梢允褂门溆姓障鄼C和測量軟件的倒置顯微鏡進行尺寸測量,。一般而言,，在前4天添加ROCK抑制劑和低bFGF培養(yǎng)基。

4）當(dāng)EB的直徑達到350-600um,，按照步驟3中所述更換培養(yǎng)基,，但不添加ROCK抑制劑和bFGF。

3,、誘導(dǎo)原始神經(jīng)上皮細胞 ● 4-5d

5）當(dāng)EB的直徑達到500-600um,，并且開始變亮、產(chǎn)生平滑的邊緣時（通常是第6天,，可見圖2b和3）,，將每個EB用200uL移液槍頭切面切下，移至低附貼壁型的24孔板中,，每孔提前加入500uL神經(jīng)細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基（圖1）,，注意不要破壞EB。關(guān)鍵步驟：用無菌剪刀裁剪200uL移液器槍頭,，以獲得直徑1–1.5mm的開口,。確保開口不要太小（會破壞EB）,，但也不要太大（將很難將EB吸到移液器吸頭中）,。請勿嘗試使用刮刀或其他工具將EB從培養(yǎng)板中移出（會破壞EB）。
6）將EB轉(zhuǎn)移至24孔板48h后,，再添加500uL神經(jīng)細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基,。
7）繼續(xù)培育2天后，在組織培養(yǎng)顯微鏡上觀察EB,。此時EB周圍應(yīng)該更亮,，表明出現(xiàn)神經(jīng)外胚層分化。一旦這些區(qū)域開始顯示與神經(jīng)上皮分化所一致的假分層上皮放射狀的形態(tài)（圖2c）（應(yīng)在神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-5d后發(fā)生）,，繼續(xù)進行步驟8,，將細胞聚集體轉(zhuǎn)移至基質(zhì)膠液滴（圖1） ）。重要步驟：健康的細胞聚集體應(yīng)該具有光滑的邊緣,。神經(jīng)上皮在外表面發(fā)育,，并且在光學(xué)上是半透明的（圖2c和3c，d）,。關(guān)鍵步驟：當(dāng)神經(jīng)上皮出現(xiàn)時，請務(wù)必及時進行步驟8,，將組織轉(zhuǎn)移至基質(zhì)膠,。不要過早轉(zhuǎn)移組織，否則會影響后續(xù)腦組織培養(yǎng)的形態(tài),。

4,、將神經(jīng)上皮組織轉(zhuǎn)移到基質(zhì)膠液滴中 ● 1-2h

8）將基質(zhì)膠放于4℃冰箱過夜融化,。
9）制作用于制備基質(zhì)膠液滴的帶凹痕封口膜。裁剪一塊正方形的封口膜,，放置在200uL槍頭盒凹痕處,，戴手套以摁壓封口膜，使其形成一個個小的凹槽,。
警告：因為不能對封口膜進行高壓滅菌,，因此在準(zhǔn)備之前，請確保在清潔的環(huán)境中使用封口膜,，并用70％（體積/體積）的乙醇對手套和封口膜進行滅菌處理,。在此步驟時，培養(yǎng)基中還應(yīng)包含抗生素以防止污染,。
10）制作一個包含4×4凹槽的封口膜（總共16個凹槽）,，并用無菌剪刀將封口膜修剪成一個小正方形。將正方形封口膜放入60mm的組織培養(yǎng)皿中,。關(guān)鍵步驟：4×4的封口膜大小適合于60mm的組織培養(yǎng)皿,。因此，每個60mm培養(yǎng)皿中總包含16個基質(zhì)膠液滴,。
11）使用剪切好的200uL移液槍頭,，將神經(jīng)上皮組織逐個轉(zhuǎn)移到封口膜的每個凹槽中。關(guān)鍵步驟：同第5關(guān)鍵步驟,。
12）用完整的200uL移液槍頭頂部小心吸出液體,，以去除每個組織中多余的培養(yǎng)基。
13）每個組織滴加約30uL的基質(zhì)膠液滴,，充盈整個凹槽,，浸潤組織。關(guān)鍵步驟：添加基質(zhì)膠需迅速,，避免組織變干,。
14）使用10uL移液槍頭將每個組織移置于基質(zhì)膠液滴的中心（圖2d）。關(guān)鍵步驟：添加液滴后必須立即進行此步驟,，基質(zhì)膠在室溫條件下便會開始凝固,。
15）將裝有基質(zhì)膠液滴封口膜的60mm培養(yǎng)皿，放回37°C培養(yǎng)箱,，孵育20-30min以使基質(zhì)膠聚合,。
16）在60mm培養(yǎng)皿中加入5mL不含維生素A的腦類器官分化培養(yǎng)基。
17）使用無菌鑷子將封口膜翻轉(zhuǎn)過來,，基質(zhì)膠滴浸潤在培養(yǎng)基中,，再攪動培養(yǎng)基使得所有基質(zhì)膠滴都從封口膜上脫離下來。繼續(xù)在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)組織液滴,。

5,、神經(jīng)上皮芽的固定培養(yǎng) ● 4d

18）培育24h后在顯微鏡下觀察基質(zhì)膠包埋的組織,。組織應(yīng)在1-3d內(nèi)開始形成更多向外擴張的神經(jīng)上皮芽，其中含有充滿液體的空腔（圖2e和3f）,。
19）繼續(xù)孵育組織24h,，然后用不含維生素A的腦類器官分化培養(yǎng)基培養(yǎng)含有神經(jīng)上皮組織的基質(zhì)膠滴，在不攪拌的情況下孵育48h,。關(guān)鍵步驟：傾斜培養(yǎng)皿,，使液滴下沉，并小心吸出培養(yǎng)基,，吸取盡可能多的培養(yǎng)基而不干擾基質(zhì)膠滴,，每次采用5mL新鮮培養(yǎng)基替換。

6,、腦組織的生長 ● 1 year

20）靜態(tài)培養(yǎng)4d后,，使用剪切開的1mL移液器吸頭（開口約3mm）將培養(yǎng)的類器官轉(zhuǎn)移至125mL的可旋轉(zhuǎn)器官培養(yǎng)瓶中（圖1），在75-100mL含有維生素A的腦類器官分化培養(yǎng)基中進行培養(yǎng),。器官培養(yǎng)瓶可以放在培養(yǎng)箱中配套的磁力攪拌板上（圖2f）,，也可以放在培養(yǎng)箱中配套的搖床上（振動速度為85rpm）。只需將每個60mm培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基替換為含有維生素A的腦類器官分化培養(yǎng)基,，然后將培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)即可,。關(guān)鍵步驟：不要轉(zhuǎn)移過多的類器官（小于32個），過多的數(shù)量會導(dǎo)致類器官融合,；確保使用驗證應(yīng)用于組織培養(yǎng)的培養(yǎng)箱低速攪拌板,。
21）如步驟9所述，全量更換培養(yǎng)基,，搖床培養(yǎng)時每3-4d更換,，旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶每周更換，并實時監(jiān)測類器官的形態(tài),。

Lancaster M A,Knoblich J A.Generation of Cerebral Organoids from Human Pluripotent Stem Cells[J].Nature Protocols, 2014, 9(10):2329-2340.

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